摘要
本文以以一株诱变得到的色氨酸生产菌株谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）TQ2223出发，通过系统代谢工程改造提高色氨酸产量。 (1)载体过表达色氨酸合成关键基因:pXMJ19载体过表达来源于大肠杆菌（Escherichia coli）TRTH携带质粒的关键基因trpEfbr DCBA-aroGC632T serA得到菌株P-1，色氨酸产量达到4.47g/L，相对于出发菌株2.76g/L，提高了61％;pXT01载体过表达不同来源的邻氨基苯甲酸合成酶的编码基因trpEGD，发酵结果表明，过表达来源于E.coli TRTH trpEfbrD基因，色氨酸产量达到4.04g/L，相比于过表达pXT01菌株2.32g/L，提高了74％;pXT01载体过表达DAHP合成酶的编码基因aroⅠ，aroⅡ和aroGC632T相比于出发菌株，色氨酸产量有所下降。 (2)在出发菌株的基因组上整合trpEfbrD(E.coli TRTH)得到菌株TP-1，色氨酸产量达到4.53g/L，提高150％。为解除色氨酸对色氨酸操纵子的反馈阻遏同时增加色氨酸操纵子的转录量，在TP-1基础上，将色氨酸操纵子的启动子替换成Ptuf强启动子得到菌株TP-2，色氨酸产量达到7.02g/L，提高56％。 (3)磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和赤藓糖-4-磷酸(E4P)是色氨酸合成前体物。为增强E4P的供应，在菌株TP-2的基础上，将转酮酶/转醛酶的编码基因tkt-tal启动子替换成3-磷酸甘油醛脱氢酶编码基因gapA的启动子，得到菌株TP-3，色氨酸的产量达到8.75g/L，提高17％。为增强前体物PEP的供应，尝试用肌醇转运系统代替磷酸葡萄糖转运系统(PTS)。在菌株TP-3基础上，敲除肌醇转运途径阻遏蛋白编码基因iolR得到菌株TP-4，色氨酸产量几乎不变，可能的原因是当PTS系统存在时葡萄糖主要通过PTS系统转运。在菌株TP-4的基础上，敲除磷酸葡萄糖转运蛋白编码基因ptsG使PTS转运系统失活得到菌株TP-5，色氨酸的产量下降到4.41g/L，同时菌体生物量明显下降。由于肌醇转运系统需要葡萄糖激酶的参与，在菌株TP-5的基础上，过表达葡萄糖激酶编码基因glK得到菌株TP-6，但是色氨酸产量和菌体生长情况无明显变化。因此，用肌醇糖转运系统替代PTS转运系统不可行。 (4)谷氨酰胺、丝氨酸和5-磷酸核糖-1-焦磷酸（PRPP）也是色氨酸合成前体物。在菌株TP-4的基础上，依次在基因组上整合谷氨酰胺合成酶编码基因glnA3，磷酸丝氨酸磷酸酶编码基因serA和核糖磷酸焦磷酸激酶编码基因prs，得到菌株TP-7，TP-8和TP-9。相比于菌株TP-4的色氨酸产量(8.51g/L)，菌株TP-7产量8.84g/L，TP-8的产量9.05g/L，而菌株TP-9色氨酸的产量达到10.02g/L。由此可见，增强前体物谷氨酰胺、丝氨酸和PRPP的供应对色氨酸合成有一定的作用。 (5)DAHP合成酶(DS)是色氨酸合成途径的关键酶。在菌株TP-9的基础上，分别整合aroⅠC544G和aroGC632T，分别得到菌株TP-10和TP-11。菌株TP-10的色氨酸产量和菌体生长情况几乎不变。菌株TP-11的色氨酸产量明显下降，菌体生物量不到对照菌株TP-9的一半，但是单位菌体产酸明显提高。 以谷氨酸棒杆菌TQ2223为出发菌株，替换色氨酸操纵子的启动子，过表达来源于E.coli TRTH trpEfbrD基因，增强前体物E4P、谷氨酰胺、丝氨酸和PRPP的供应，得到菌株TP-9，摇瓶发酵色氨酸的产量达到10.02g/L。肌醇转运系统替代PTS转运系统和过表达关键酶DAHP合成酶的编码基因，不能提高色氨酸的产量。
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