摘要
青虾，学名日本沼虾（Macrobrachium nipponensis），俗称河虾，是我国重要的淡水养殖虾蟹类品种之一，其具有生长速度快、适应性广、繁殖力强、经济价值高等特点。青虾性成熟时间短，放养45天左右雌虾就开始繁殖后代，俗称“秋繁”，导致多代同堂、养殖密度过高、饲料消耗增大、缺氧风险等诸多问题，这是多年来一直困扰青虾养殖的问题，严重影响了养殖的经济效益。开展青虾生殖调控机制的研究，对解决“秋繁”问题意义重大。另一方面，青虾雌雄个体生长差异显著，雄虾的平均规格比雌虾大2-2.5倍，全雄化养殖可以极大地提高青虾的产量和经济效益。性别控制技术是实现青虾单性化养殖的基础，因此确定青虾性别决定基因及其调控机制具有重要意义。 基于前期构建的雌性青虾繁殖期和非繁殖期眼柄和脑的转录组，筛选到多个参与青虾生殖调控的候选基因片段，本文挑选生殖相关生物钟基因period(per)和timeless(tim)的EST序列，在此基础进行cDNA克隆、成体组织表达以及时序表达模式分析。采用快速扩增cDNA末端(rapid-amplification of cDNA ends，RACE)技术获得青虾period基因(Mnper)和timeless基因（Mntim）的全长cDNA序列。Mnper的cDNA序列长4283bp(GenBank登录号，KX097991)，ORF(Open reading frame)共编码1292个氨基酸，氨基酸序列结构域分析得出Mnper蛋白包含一个PER-ARNT-SIM(PAS)结构域，核定位信号域(nuclear localization signal，NLS)、结合TIM蛋白的结构域(TIM interaction site，TIS)和胞质定位域(cytoplasmic localization domain，CLD)。Mntim蛋白全长5692bp(GenBank登录号，KX097992)，其中ORF全长4620bp共编码1540个氨基酸，氨基酸序列结构域包含一个核定位信号域(NLS)和结合PER蛋白的结构域(PER interaction site，PIS)，和胞质定位域(CLD)。雌雄威体组织表达的分布结果相似，在各个组织中均有表达，且在眼柄中表达量最高，其次是脑。在人工模拟的繁殖期(LD14∶1025℃)和非繁殖期(LD10∶1415℃)的环境中养殖雌虾两周，对上述两个基因在眼柄、脑和卵巢的时序表达进行分析:眼柄中Mnper和Mntim基因的模式几乎未受到影响(P＞0.05）;但脑中Mnper和Mntim基因表现出显著的季节性差异(P＜0.05），由此推测脑是这两个生物钟基因行使功能的主要部位;Mnper和Mntim在卵巢中也呈现了季节性的表达变化(P＜0.05）。Mnper和Mntim在卵巢不同发育阶段的眼柄、脑和卵巢中呈现出相同的表达规律，在Ⅰ期（卵原细胞增殖期）表达量最高，Ⅱ期（卵巢发育成熟期）次之，Ⅲ期（卵巢发育消退期）表达量最低。上述研究结果表明，Mnper和Mntim基因与雌性青虾生殖密切相关，可能参与了青虾季节性生殖调控。 transformer-2(tra-2)基因和sex-lethal(sxl)基因在昆虫的性别决定机制中起着至关重要的作用。本实验室前期已获得的青虾性别相关候选基因transformer-2（Mntra-2）和sex-lethal(Mnsxl)，本文基于上述研究基础，运用RNA干扰技术研究这两个基因之间的相互关系。青虾成体组织表达的数据显示，Mntra-2在肌肉组织中表达量最高，而青虾Mnsxl基因在肝胰腺中的表达量最高。RNA干扰实验结果显示Mntra-2和Mnsxl基因的表达显著地受到抑制(P＜0.05)。qPCR结果显示Mntra-2基因在雌雄肌肉中的表达量分别下降了70％、86.8％，精卵巢的表达量分别下降了92％、67.4％。Mnsxl基因的mRNA水平也显著下降(P＜0.05)，在雌雄的肝胰腺组织中分别下降了80％、90％，精卵巢中分别下降了85％、90％。此外，干扰Mntra-2基因后，Mnsxl基因的表达也随之受到抑制（P＜0.05），但是干扰Mnsxl基因后，Mntra-2基因的表达并未受到影响(P＞0.05)。以上结果表明，Mntra-2是Mnsxl的上游基因，并起正向调控作用。本研究结果为青虾性别决定机制的研究提供了重要的参考依据，同时也为虾蟹类其它物种性别决定机制研究提供借鉴。
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