摘要
德国小蠊（Blattella germanica）是世界上分布极为广泛的室内卫生害虫，它能机械性的携带多种病原菌，导致人类腹泻、痢疾等疾病。化学杀虫剂的广泛使用，使德国小蠊产生了严重的抗药性，迫切需要一种长期有效的替代策略来控制这些害虫。其中以病原真菌为主要成分的微生物源生物防治制剂发展迅速，具有良好的应用前景。金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae）是德国小蠊生物防治中研究较多的丝孢类真菌，它在防治蚊子、蝗虫、蟑螂等200多种昆虫上都发挥着重要的作用。本论文从罹病的中华真地鳖（Eupolyphaga sinensis）虫尸上分离出一株高毒力绿僵菌，并以在实验室培育的敏感品系（Sensitive，S）和抗高效氯氰菊酯品系（Resistant，R）德国小蠊为研究对象，从不同发育阶段的德国小蠊对绿僵菌的敏感性、组织病理学、肠道菌群的变化以及免疫应答等多个角度揭示该菌株对除虫菊酯抗性德国小蠊的生防机理，为绿僵菌生防制剂的应用开发奠定基础。该研究获得了以下实验结果： 1．M.anisopliaeEB0732的分离鉴定 从罹病的中华真地鳖虫尸上分离出一株疑似金龟子绿僵菌的菌株，经形态学鉴定和分子生物学鉴定，其菌落特征和孢子形态等均符合金龟子绿僵菌的典型性状；经ITS序列分析，多序列同源性比对，构建系统发育树，并提交到TreeBASE数据库中（ID23084），该菌株与M.anisopliaeMa-58的同源性达到95%，依据以上结果，将该菌株鉴定为金龟子绿僵菌（M.anisopliae isolate EB0732），并于2016年11月15保存于中国微生物菌种保藏中心（CGMCCNO.:13170）。 2．德国小蠊对M.anisopliaeEB0732的易感性 评估了该菌株不同浓度的分生孢子（1×105，1×106，1×107，1×108和1×109conidia/ml）对R、S品系德国小蠊不同发育阶段的雌雄个体的敏感性。不管是S品系还是R品，都呈现浓度依懒性，随着孢子浓度增加，试虫死亡率升高；且除高龄若虫外（6-7龄），虫龄越高，死亡率越低（P＜0.05）。德国小蠊对绿僵菌敏感程度的基本顺序：1-3龄若虫＞4-5龄若虫＞成年雄虫>成年雌虫＞6-7龄雄性若虫＞6-7龄雌性若虫。德国小蠊性别之间的死亡率总体上显著差异，雄虫死亡率高于雌虫（P＜0.05）。R、S品系死亡率相比，R品系整体死亡率均明显高于S品系，在低龄阶段，差异更加显著（P＜0.05），如低浓度的绿僵菌孢子浓度下（1×105conidia/ml），R品系1-3龄若虫15d累计死亡率达到100%，S品系累计死亡率仅为65%。 3．组织病理学研究 通过石蜡切片观察R、S品系德国小蠊（雌雄成体）体表感染绿僵菌（1×108conidia/ml）后的组织病理学变化。结果显示，雄性感染进程明显快于雌性，以S品系雄虫为例，感染1d，孢子附着于体壁，形成侵蚀钉，并穿透外骨骼，经脂肪层，达到血腔；随着时间的推移（2d），肠道中发现少量孢子。感染3-4d，病虫皮细胞层、脂肪体、血腔、生殖腺与消化道中已有相当量的菌丝存在。感染5-6d血腔结构发生变化，隔膜消失，血腔内充满菌丝，细胞出现空洞；肌肉组织也出现了一定程度的缝隙，肌纤维的完整性受到破坏。死亡僵虫体表及血腔中布满分生孢子与菌丝（7-8d）。R品系雌雄虫感染速率均明显快于S品系，雄虫感染第1d分生孢子已经穿透外骨骼及进入血腔，少量孢子甚至已穿过肠壁外层，进入肠道；感染3-4d，肠道，血腔以及肌肉组织等已遭到严重破坏，血腔内充满大量菌丝和孢子，与毒力测定结果保持一致。 4．绿僵菌感染后肠道菌群的变化 对绿僵菌感染德国小蠊72h后肠道细菌16S rRNA基因V6高变区进行高通量测序，比较R、S品系德国小蠊肠道菌群的变化。OUT聚类分析显示两品系德国小蠊均主要以厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、梭杆菌门（Fusobacteria）及浮霉菌门（Planctomycetes）为主。但厚壁菌门（感染前R：39.37%vs.S：32.53%；感染后R：47.42%vs.S：34.91%）和变形菌门（感染前R：30.57%vs.S：39.25%；感染后R：28.09%vs.S：40.42%）相对丰度存在显著差异（P＜0.05），表明两品系肠道菌群有较大差异。选择相对丰度排名前15的优势属，比较R、S品系肠道菌群的差异性，结果显示：Parabacteroides（2.975%vs.9.292%）、Enterococcus（5.25%vs.3.556%）、Lachnocl ostridium（2.475%vs.5.934%）、Anaerotruncus（3.814%vs.2.406%）、Weissella（4.729%vs.1.384%）存在显著差异（P＜0.05）。绿僵菌感染后，两品系在Parabacteroides（3.092%vs.8.473%）、Porphyromonadaceae（1.536%vs.4.282%）、Lachnoclostridium（2.435%vs.5.286%）、Tyzzerella_3（1.381%vs.6.786%）四个属水平上出现显著差异。 5．免疫基因的动态变化 采用qRT-PCR的方法，验证不同侵染时间（12h、36h、48h、72h、84h、108h）R、S品系抗真菌免疫基因（AKIRIN、BgPo、CYP5G19、BgChi、BgTPS）的表达情况，发现感染绿僵菌后，免疫基因均出现不同程度的上调或下调，且两品系表达量存在差异，其中AKIRIN、BgPo和BgTPS基因S品系表达量高于R品系（P＜0.05）；CYP5G19基因表达量R品系表达量高于S品系（P＜0.05）；而BgChi基因，在感染前期（12-48h）S品系的表达量高于R品系，在感染中后期（72-108h）R品系的表达量升高，高于S品系（P＜0.05）。两品系抗真菌免疫基因的应答反应不同，可能是造成R、S品系绿僵菌感染后德国小蠊死亡率差异的重要原因。 6．RNAi沉默抗真菌免疫基因 通过注射双链RNA的方法对R、S品系抗真菌免疫基因（AKIRIN、BgPo、CYP5G19、BgChi、BgTPS）进行RNAi。结果发现，在进行了基因干扰后，免疫基因的表达下调明显。且RNAi后，德国小蠊抵御绿僵菌感染的能力变弱，实验组德国小蠊的死亡率较对照组（R：55%±0.00%vs.S：50%±0.00%）出现了不同程度的升高；其中BgChi基因干扰后，R、S品系对绿僵菌最易感，10d后累计死亡率达到100%。另外CYP5G19基因在干扰后，R、S德国小蠊的死亡率分别为：100±0.00%和73.33±2.89%，干扰效果较为明显（P＜0.05）。而BgPo效果较差，感染绿僵菌仅造成R、S品系75±0.00%和55.00±5.00%的死亡率。这进一步说明了宿主在感染早期启动了免疫防卫反应，且免疫基因在抵御金龟子绿僵菌感染过程中发挥了重要作用。
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