摘要
本实验以核黄素工程菌B.subtilis120和B.subtilis X42为出发菌，通过基因组重排技术获得核黄素工程菌B.subtilis1-1，随后经过摇瓶发酵培养基优化实现核黄素产量提升。在5L-发酵罐放大培养中，通过优化发酵工艺和培养基组成实现了核黄素产量的进一步提升，在120h的发酵周期内，菌株B.subtilis1-1核黄素产量达到18.5g/L，核黄素得率为0.119g/g葡萄糖。本实验还以B.subtilis120spc为出发菌，过表达异源β-1,4-木聚糖内切酶和β-木糖甘酶，以及异源木糖利用相关酶，实现了菌株高效利用木聚糖生产核黄素。 首先对B.subtilis X42进行复壮，并将其作为亲株一。往B.subtilis120染色体中引入spc基因用以作为原生质体融合筛选标记，获得的工程菌B.subtilis120spc为亲株二。利用基因组重排技术将两株亲株进行重排，通过筛选获得核黄素高产融合子B.subtilis1-1。该菌株摇瓶核黄素产量可达7443.66±102.54mg/L，核黄素得率可达93.87±1.00mg/g葡萄糖，与亲株B.subtilisX42相比分别提高了11.04%和16.53%. 通过优化摇瓶发酵培养基，发现当培养基尿素浓度为2g/L，酵母粉：酵母浸粉=19:1（有机氮源总浓度为20g/L）时，B.subtilis1-1核黄素产量可达8557.11±93.45mg/L，核黄素得率为122.74mg/g葡萄糖，与优化前培养基相比分别提高了15.00%和30.75%。 随后本实验将菌株B.subtilis1-1在5L-发酵罐中进行了放大培养，通过葡萄糖限制流加发酵和培养基优化，在120h的发酵周期内，菌株B.subtilis1-1核黄素产量达到18.5g/L，核黄素得率为0.119g/g葡萄糖。 最后本实验以B.subtilis120spc为出发菌，先在染色体上整合表达源于粪堆梭菌的xyn10B基因和月形单胞菌GA192的xsa基因，随后过表达源于大肠杆菌的糖异构酶基因xylA和木酮糖激酶基因xylB，并同时过表达B.subtilis內源木糖运输蛋白表达基因araE，获得菌株B.subtilis E2X6PAB，该菌株能够高效利用木聚糖为碳源生产核黄素，在初糖浓度为49g/L木聚糖和1g/L木糖的摇瓶发酵中，其核黄素产量为2484.303±25.9mg/L，核黄素得率约为49.67±0.5mg/g葡萄糖。结果证实了利用木聚糖生产核黄素的可行性。
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