摘要
研究背景与目的 在我国胃癌是一个不容忽视的健康问题，发病率和死亡率极高且预后相对较差。代谢重编程是癌症特征之一，谷氨酰胺分解代谢是代谢重编程的重要途径，谷氨酰胺作为一种条件性非必需氨基酸，它的分解代谢在提供生物能、生物大分子和维持氧化还原平衡方面扮演了重要角色。谷氨酰胺酶是谷氨酰胺分解代谢的关键酶，本课题组前期研究发现胃癌组织中谷氨酰胺酶1（GLS1）是高表达的，胃癌细胞MGC803和SGC7901的生长依赖谷氨酰胺，细胞中GLS1酶活性较高，提示抑制谷氨酰胺酶的活性有望成为有效的肿瘤治疗手段。本实验利用谷氨酰胺酶1特异性抑制剂CB-839研究谷氨酰胺酶1的抑制对胃癌细胞生物学行为的影响及其可能的分子机制，为靶向谷氨酰胺酶临床治疗胃癌和药物研发提供实验依据和理论基础。 方法 1. 采用 CCK-8 法测定不同浓度梯度的谷氨酰胺酶抑制剂 CB-839 对胃癌细胞MGC803和SGC7901增殖活力的影响，分别计算CB-839对胃癌细胞MGC803和SGC7901的IC50值。 2. 采用平板克隆实验检测谷氨酰胺酶抑制剂CB-839处理胃癌细胞MGC803和SGC7901后对细胞克隆形成的影响。 3. 采用流式细胞术检测谷氨酰胺酶抑制剂 CB-839 处理胃癌细胞 MGC803 和SGC7901后两种细胞凋亡的变化。 4. 采用划痕实验检测谷氨酰胺酶抑制剂 CB-839 处理胃癌细胞 MGC803 和SGC7901后两种细胞迁移能力的改变。 5. 采用Transwell实验检测谷氨酰胺酶抑制剂CB-839处理胃癌细胞MGC803和SGC7901后两种细胞侵袭能力的变化情况。 6. 用试剂盒检测谷氨酰胺酶抑制剂CB-839处理胃癌细胞MGC803和SGC7901后细胞中活性氧水平的升降。 7.采用Western Blot方法检测MYC，p473-AKT，p-AMPKα，p-ERK，pT389-P70S6K，Bax，Bcl-2的蛋白表达水平。 结果 1. 根据CCK8实验结果计算出CB-839对MGC803和SGC7901细胞的IC50值分别是0.14±0.09 μmol/L和13.93 ±1.14 μmol/L，表明CB-839对两种胃癌细胞均产生增殖抑制作用，并具有一定浓度依赖性。 2. 与对照组（DMSO处理组）相比，用1?mol/L的CB-839处理两种细胞10天后，细胞克隆形成数目明显减少。 3. 与对照组相比，用1μmol/L的CB-839处理两种细胞24 h后，MGC803细胞的总凋亡率(1.53±0.12)%上升至(11.80±0.64)%，SGC7901的总凋亡率从(1.10±0.08)%上升至(4.93±0.17)%，两种细胞凋亡率均显著增高（p<0.05）。提示抑制谷氨酰胺酶1可以诱导细胞凋亡。 4. 与对照组相比，MGC803和SGC7901细胞分别用70 nmol/L和1μmol/L CB-839处理 24 h 后，MGC803 细胞的迁移率从(14.91±6.5)%下降到(8.37±2.08)%，SGC7901的迁移率从(13.42±7.29)%下降到了(9.87±2.6)%。 5. 与对照组相比，分别用 70 nmol/L 和 1μmol/L CB-839 处理 MGC803 和SGC7901细胞,24 h后MGC803侵袭的细胞数从2248±471下降为958±180，SGC7901侵袭细胞数从1651±154下降为1166±364，两种细胞侵袭数目均显著下降（p<0.05）。 6.与对照组相比，用1μmol/L的CB-839处理两种细胞24 h后，MGC803活性氧水平从(41.84±1.93)%提高到(98.33±0.24)%，SGC7901 中活性氧水平从(56.47±2.16)%提升至(65.17±2.85)%。 7.两种细胞经1μmol/L的CB-839处理24 h，与对照组相比，MGC803和SGC7901细胞中p473-AKT和p-AMPKα的蛋白表达水平无显著差异，而MYC、p-ERK、pT389-P70S6K和Bcl-2的蛋白表达降低，Bax的蛋白表达升高。 结论 抑制谷氨酰胺酶1可诱导胃癌细胞凋亡，减少胃癌细胞克隆形成，降低胃癌细胞迁移、侵袭能力，其机制可能与胃癌细胞内活性氧的增多，氧化还原平衡的破坏，ERK和P70S6K磷酸化水平的下调有关。提示GLS1对胃癌细胞多种生物学行为有影响，抑制GLS1活性可以用来治疗胃癌。
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