摘要
目的： 食管癌是最常见的恶性肿瘤之一，也是全球癌症相关死亡率最致命的原因之一。根据组织学类型，食管癌主要分为食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）和食管腺癌（esophageal adenocarcinoma，EAC）。在亚洲，特别是在中国，超过90％的食管癌患者以食管鳞癌为主。化学药物治疗在ESCC的综合治疗中占据重要地位，但是，在化疗过程中肿瘤组织中部分肿瘤细胞会对化疗药物产生耐药性，同时伴有对其他多种具有不同结构和作用机制的化疗药物产生耐药，即多药耐药（multi-drug resistance，MDR），最终导致治疗失败和肿瘤的复发。因此，研究肿瘤多药耐药的具体分子机制，寻找低毒、高效、作用靶点广泛的抗肿瘤多药耐药的逆转剂意义重大。 许多黄酮类化合物已经被证实在动物和细胞模型中均具有抗癌活性，因其具有高效、低毒、易得等优势，受到国内外学者的广泛关注。木犀草素是最常见的天然黄酮类化合物之一，具有肿瘤预防和治疗潜力。近些年研究发现木犀草素通过多种机制阻碍肿瘤细胞的发生、转移和血管生成等进展，同时木犀草素可以逆转多种肿瘤细胞的多药耐药性，增加肿瘤耐药细胞的化疗药物敏感性，还可以改善多种化疗药物引起的细胞毒性。总之，木犀草素可以作为辅助治疗药物参与逆转肿瘤细胞的多药耐药过程，但是具体的作用机制有待探究。 本实验室前期工作中已成功建立并鉴定人食管鳞癌紫杉醇多药耐药细胞EC1/PTX，通过高通量测序及前期研究发现，ESCC多药耐药细胞较亲本细胞高表达耐药相关蛋白P-gp、BCRP、MRP1以及黏着斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）和磷酸化的FAK，同时磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信号通路可能参与了ESCC细胞的多药耐药过程。FAK激活后可促进肿瘤细胞发生上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），参与肿瘤的侵袭转移，而ErbB2激酶可以被FAK所招募，二者的激活可以引发Src激酶的激活，进而调节PI3K/AKT、MAPK等信号通路，促进肿瘤的侵袭转移和化疗耐药。 为了进一步探究FAK/Src/PI3K/Akt信号途径是否参与ESCC细胞的多药耐药过程，而木犀草素是否抑制该信号途径而逆转ESCC细胞的多药耐药。因此，首先通过细胞形态学、生物学和药物敏感性探究木犀草素抗ESCC细胞多药耐药的作用，其次阐明木犀草素逆转ESCC细胞多药耐药的分子机制。本实验通过研究木犀草素逆转ESCC多药耐药细胞的作用及其分子机制，明确其抗ESCC细胞多药耐药性的潜在治疗靶点，为木犀草素作为ESCC细胞多药耐药的理想逆转剂提供实验基础和理论支持。 方法： 1.木犀草素对ESCC多药耐药细胞形态学和生物学行为的影响 不同浓度木犀草素作用于EC1/PTX细胞，48h后倒置显微镜观察细胞形态学的变化；CCK-8法和平板克隆实验检测细胞增殖和克隆形成能力；流式细胞术检测细胞的周期和凋亡；划痕实验和Transwell小室法检测细胞迁移和侵袭能力；微球体形成实验检测细胞的成球能力；Western blot实验检测细胞中凋亡、EMT和干细胞相关蛋白的表达变化。 2.木犀草素对ESCC多药耐药细胞药物敏感性的影响 木犀草素（10μM）预处理EC1/PTX细胞，然后分别加入不同浓度的化疗药物紫杉醇、顺铂、多柔比星和五氟尿嘧啶，CCK-8法检测细胞的增殖，并计算化疗药物的IC50值。同时木犀草素或紫杉醇单用和两种药物联用分别作用于EC1/PTX细胞，流式细胞术检测细胞的总凋亡率。 3.FAK/Src/PI3K/Akt信号途径在ESCC多药耐药细胞中的作用 Western blot验证耐药细胞EC1/PTX与亲本细胞EC1中FAK/Src/PI3K/Akt通路关键蛋白的表达水平；通过特异性抑制剂阻断该通路后，Western blot检测ESCC多药耐药细胞中FAK/Src/PI3K/Akt通路关键蛋白以及耐药相关蛋白的表达变化。 4.木犀草素对ESCC多药耐药细胞中FAK/Src/PI3K/Akt信号途径的作用 Western blot检测不同浓度木犀草素对EC1/PTX细胞中FAK/Src/PI3K/Akt通路中关键蛋白以及耐药相关蛋白的表达变化。 5.统计学处理 实验数据采用统计学软件SPSS21.0进行分析处理。对于服从正态分布的两组样本均数间比较采用独立样本t检验，多组间采用单因素方差分析进行比较，P＜0.05表示具有统计学差异。 结果： 1.木犀草素抗食管鳞癌细胞多药耐药的作用 1.1 细胞形态学观察结果显示，对照组细胞排列均匀，细胞之间紧密连接，细胞呈多边形，形态正常，边缘清晰，培养基无浑浊；而木犀草素处理后，大多数细胞失去正常形态，细胞间连接消失，边缘模糊，细胞呈现皱缩且聚团生长，悬浮的死细胞增多。 1.2 生物学行为实验结果表明，与对照组相比，不同浓度木犀草素均能够抑制EC1/PTX细胞的增殖和克隆形成能力，阻滞细胞的周期进程，诱导细胞凋亡，同时促进促凋亡蛋白Bax的表达，抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达。此外，木犀草素抑制了细胞的迁移、侵袭和成球能力，同时抑制了细胞中TGF-β1诱导的EMT的发生和干性化，Western blot结果表明木犀草素下调细胞中间质标志物Snail、N-cadherin和MMP-2蛋白及干细胞标志物SOX-2、CD44和CD133的表达水平。 1.3 药物敏感实验结果表明，与无预处理组相比，木犀草素预处理组EC1/PTX细胞中紫杉醇、顺铂、多柔比星和五氟尿嘧啶的IC50值分别降低了1.5、2.7、1.9和3.0倍，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。同时，流式细胞术检测结果发现，与木犀草素和紫杉醇单用组相比，木犀草素和紫杉醇联用组细胞的总凋亡率显著增加（P＜0.05）。 2.木犀草素抗食管鳞癌细胞多药耐药的分子机制 2.1 FAK/Src/PI3K/Akt信号途径在ESCC多药耐药细胞中的作用 Western blot结果证实，与亲本细胞EC1相比，耐药细胞EC1/PTX中Akt、p-Akt（Ser473）、p-Src（Tyr416）和ErbB2的表达水平均上调（P＜0.05）。 Y15和LY294002阻断FAK/Src/PI3K/Akt信号途径后，Western blot结果表明，与对照组相比，Y15处理组细胞中总的FAK和p-FAK蛋白的表达均被下调，下游蛋白ErbB2、p-Src（Tyr416）、Akt、p-Akt（Ser473）及耐药蛋白P-gp、BCRP和MRP1的表达水平均被显著下调，且呈剂量的依赖性（P＜0.05），而总的Src蛋白表达无变化。同时LY294002处理组细胞中Akt、p-Akt（Ser473）和耐药蛋白P-gp、BCRP和MRP1的表达水平均被显著下调，且呈剂量的依赖性（P＜0.05）。 2.2 木犀草素对ESCC多药耐药细胞中FAK/Src/PI3K/Akt信号途径的作用 Western blot结果显示，与对照组相比，木犀草素处理组细胞中FAK、p-FAK（Tyr397）、ErbB2、Src、p-Src（Tyr416）和Akt、p-Akt（Ser473）及耐药蛋白P-gp、BCRP和MRP1的表达水平均被显著下调，且呈剂量的依赖性（P＜0.05）。 结论： 1.木犀草素能够抑制ESCC多药耐药细胞的增殖、迁移、侵袭、EMT以及成球能力和干性，阻滞周期、诱导凋亡，同时增加细胞药物敏感性。 2.木犀草素可能通过抑制FAK/Src/PI3K/Akt信号途径逆转ESCC细胞的多药耐药。
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