摘要
人表皮生长因子（human Epidermal Growth Factor，hEGF）是一种重要的小分子多肽物质，能够影响多种细胞的生长和分化，尤其是皮肤细胞的增殖，因此在医药行业和化妆品行业具有重要的应用价值。然而化学合成hEGF的高成本和低纯度等问题，一直严重制约着其大规模推广应用。因此利用植物或酵母等宿主作为hEGF的生物反应器进行异源合成，引起了人们的极大关注。 植物毛状根生产技术是一种崭新且快捷的获取外源蛋白的重要方式。本研究基于植物毛状根技术，以宿主安全性为首要考虑条件，以转基因宿主整体开发利用为主要目的，以大量提取纯化hEGF为重要目标，开发hEGF的生物安全生产技术。选取农业生产上已经证明比较安全的植物材料花生（优良牧草）和抗病毒的优良中草药菘蓝（叶片可食）作为植物宿主，建立安全的hEGF毛状根表达系统，并探究在不同的植物生物反应器中hEGF的蛋白表达能力差异和hEGF促进动物细胞增殖的活性差异。鉴于毕赤酵母表达系统的优良特点，如容易大规模发酵，外泌表达蛋白，容易纯化等优势。本研究将多个独立的hEGF表达盒串联并行到外泌表达载体中，且在构建表达载体过程中避免标记基因引入，提高表达hEGF的安全性，探究转化毕赤酵母GS115菌株从而量产hEGF的可行性。 通过上述研究以期建立有效、安全、高效的hEGF表达体系，为利用植物毛状根技术开发hEGF提供新的更具有安全性的表达系统和利用毕赤酵母表达hEGF提供新的实验方法。主要研究结果简述如下： （1）首次以花生为宿主，建立了hEGF的花生毛状根表达体系；结果显示转hEGF花生毛状根株系不仅能够有效表达hEGF，而且表达的hEGF能够显著促进动物细胞的增殖活性，证明花生毛状根表达的蛋白是具有生物学活性的。氨基酸序列鉴定结果表明，植物生物反应器表达的hEGF氨基酸C端序列与天然的hEGF氨基酸C端序列完全一致，表明花生毛状根表达的蛋白确实是hEGF。 （2）转hEGF花生毛状根培养条件简单，仅需普通的MS培养基即可，且无需添加任何外源激素。此外在体外培养条件下，毛状根的生物量增加迅速，连续培养10周仍保持旺盛的生长能力，因此具备放大培养的潜力且具备无限繁殖能力，具有较大应用潜力。 （3）毛状根内源成分测定实验结果显示，转hEGF花生毛状根能够合成大量的白藜芦醇和总黄酮，表明转hEGF花生毛状根不仅能够合成hEGF，而且能够合成原有的药用成分，因此具备一株多用能力，为花生毛状根株系的整体开发利用奠定了实验基础。 （4）建立了高效的发根农杆菌R1601和R1601-hEGF介导的菘蓝毛状根遗传转化体系，为菘蓝的植物毛状根技术研究提供了实验基础。然而相对而言，转hEGF菘蓝毛状根继代培养8周已完全褐化，不适于持续培养，因此菘蓝毛状根体系略差于花生体系。 （5）从生物量积累、hEGF表达水平、继代培养优势和其它药用成分合成等方面对花生毛状根系统和菘蓝毛状根系统进行比较，综合结果表明花生毛状根具备较多的优势，因此是更适合hEGF的植物表达宿主，有望作为hEGF表达宿主进行大规模培养，有潜在的应用价值和商业潜力。 （6）首次构建了分别含有1到6个hEGF的独立多表达盒载体，并分别转入毕赤酵母GS115，构建了工程菌株。结果表明不同的工程菌株均能有效表达hEGF，且表达的hEGF具有生物学活性，质谱测序结果表明，多独立表达盒表达的hEGF的C端序列与天然hEGF C端序列完全一致。此外hEGF多独立表达盒没有引入标记筛选基因，极大的提高了后续的药用安全性。为利用毕赤酵母工程菌株表达hEGF提供了新的实验方法。 （7）筛选到了含有6个密码子优化的独立表达盒毕赤酵母GS115菌株，且hEGF的表达能力最高可达14.19mg/L，且该菌株同样没有引入标记筛选基因，为毕赤酵母的高密度安全发酵奠定了实验基础和理论支持。
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