摘要
B-box（BBX）蛋白是一类包含B-box结构域的锌指转录因子，在动、植物中参与基因的表达调控。植物BBX蛋白在幼苗光形态建成、开花调控以及植物激素转导过程中发挥重要作用。近年发现拟南芥的一个BBX蛋白（AtBBX5）与植物抵抗非生物胁迫有关。本实验室在前期苹果胁迫转录组中发现MdBBX1在盐胁迫下表达量明显上调，但它是否与植物抗胁迫功能有关尚不清楚。本文通过荧光定量PCR技术对该基因在苹果幼苗中不同胁迫条件下的表达量进行了分析；克隆该基因后，在原核细胞中诱导表达该蛋白，探究了重组表达MdBBX1对大肠杆菌抵抗非生物胁迫能力影响；在拟南芥中超表达MdBBX1，探究其是否具有增强拟南芥抵抗非生物胁迫的能力，并进一步探讨该基因参与植物应对非生物胁迫的应答机制。主要研究结果如下： （1）MdBBX1的生物信息学分析。实验室前期结果发现MdBBX1在盐胁迫下诱导表达上调10倍左右，MdBBX1的编码基因在GenBank中的注册号为LOC103442491，该基因定位在苹果第1条染色体上，其cDNA全长为1023bp，包含长度为1020bp的开放阅读框，编码含有340个氨基酸残基的多肽链，预测其分子量为38.139kDa，等电点为6.01。同源序列比对及蛋白聚类分析表明，MdBBX1在氨基末端包含两个B-box结构域，在羧基末端含有一个保守的CCT结构域，是一个典型的BBX蛋白。 （2）MdBBX1的亚细胞定位与组织表达模式分析。将MdBBX1与GFP基因融合后转化烟草叶片，结果显示MdBBX1定位在细胞核中，与其他已知的植物BBX的亚细胞定位相同，也与BBX蛋白作为转录因子参与基因表达调控的结论相吻合。利用qRT-PCR技术，探究了MdBBX1在苹果不同组织中的表达情况，发现MdBBX1在根、茎、叶、花、果器官中均有不同程度的表达，其中在叶中的表达量最高。 （3）MdBBX1在苹果幼苗中受多种非生物胁迫的诱导表达。利用在线软件PlantCare对MdBBX1启动子序列进行了预测分析，发现存在多种与胁迫响应相关的元件，如ABRE元件、MBS元件、LTR元件、P-box元件等，推测该基因的表达响应非生物胁迫。对1年生苹果幼苗进行各种胁迫处理，发现在NaCl、PEG、4℃和外源ABA条件下胁迫处理后，MdBBX1表达量均有一定程度的上调，其中在ABA处理后，MdBBX1在苹果根中的表达量上调120倍左右，PEG处理后，MdBBX1在苹果叶片中的表达量上调20倍左右，结果表明MdBBX1的表达受非生物胁迫的诱导。 （4）重组表达MdBBX1可以提高大肠杆菌的抗非生物胁迫能力。在分别含有NaCl、KCl以及甘露醇的固体胁迫培养基上，培养重组表达MdBBX1的大肠杆菌，以转化空质粒的菌株为对照，结果显示MdBBX1的表达明显提高了细胞的抗非生物胁迫能力，其菌落数明显多于对照；在分别含有NaCl、KCl以及甘露醇液体胁迫培养基中，MdBBX1表达也明显提高大肠杆菌了对胁迫的耐受性，其生长速度显著高于对照，比对照提前4h进入对数生长期。固体胁迫与液体胁迫培养都表明MdBBX1可以提高大肠杆菌在非生物胁迫条件下的忍耐能力。 （5）拟南芥中表达MdBBX1提高了其对不同非生物胁迫的耐受性。利用花序浸染法获得了稳定遗传的T3代MdBBX1超表达纯合株系。正常生长条件下，MdBBX1超表达植株（OE）与野生型植株（WT）的种子萌发率及生长状态无明显差别，但在分别含有NaCl、Manntiol和外源ABA培养基上，OE种子的发芽快且萌发率显著高于WT，OE植株的根长也明显比WT的长，对20d苗龄的拟南芥分别进行NaCl、PEG胁迫处理后，OE出现叶片萎蔫、黄化现象时间晚且程度轻，其存活率显著高于WT植株；NBT染色实验发现，OE植株中O2.-积累量明显低于WT植株。结果表明MdBBX1的表达可以提高拟南芥抗非生物胁迫的能力。 （6）MdBBX1提高植物抗逆性与ABA信号途径及活性氧（ROS）途径有关。为探究MdBBX1的抗逆机制，我们检测了胁迫处理前后OE植株与WT植株中ABA信号途径以及ROS途径中相关基因的表达量变化。用250mM的NaCl溶液处理后，WT植株与OE植株中ABA信号途径相关基因ABA1、ABA2、NCED3、RD29A以及ROS清除途径相关基因SOD、CAT的表达量都有所提高，但是OE植株与WT植株相比，相关基因的表达倍数上调更加显著，说明MdBBX1可能通过ABA信号途径与ROS途径参与胁迫响应。
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