摘要
microRNAs（miRNAs）是一类内源性功能小RNA，在动物中广泛参与细胞分化、发育形态、神经系统发育、肌肉的发育和维持细胞存活等方面的调控，主要在转录后水平通过降解靶基因mRNA、抑制翻译等作用机制调控基因表达。蚕丝蛋白基因的表达不仅有转录因子的协同参与，而且还和miRNAs在转录后水平的调控有着密切的联系。虽然有很多蚕丝蛋白合成调控机制的报道，但其精密的调控机制尚未完全清晰。研究家蚕miRNAs对蚕丝蛋白表达的调控作用，有助于深入了解miRNAs的功能，并为阐明蚕丝蛋白合成调控的分子机制提供新的实验数据。本研究以家蚕丝素轻链基因为靶基因，采用生物信息学分析获得2个候选miRNAs，即miR-2805和miR-0031-3p；在半定量RT-PCR进行表达水平分析的基础上，分别构建靶基因和miRNAs的重组表达载体，利用双荧光素酶报告基因检测系统和qRT-PCR技术，分别在细胞、离体组织和个体水平分析miRNAs对靶基因的调控作用，取得以下主要结果。 1、生物信息学预测到2个调控BmFib-L表达的候选家蚕miRNA 从miRBase下载家蚕miRNAs和本实验室前期测序获得可能参与蚕丝蛋白调控的35个新家蚕miRNAs，利用生物信息学软件RNAhybrid分析，根据miRNA5’端的第2-8碱基（种子序列）与靶位点的配对水平和折叠自由能＜?20.0kcal/mol的原则，筛选出2个对BmFib-L具有潜在调控作用的候选家蚕miRNA，即miR-2805和miR-0031-3p，进行后续的验证实验。 2、建立了一种TC-100培养基体外培养丝腺组织进行基因瞬时表达分析的方法 取健康家蚕5龄2d幼虫，解剖获取丝腺组织，放入含有800μL TC-100培养基的12孔细胞培养板中，每孔4条丝腺，27℃培养。将构建的含有绿色荧光蛋白的表达载体pcDNA3.0[ie1-egfp-SV40]用EntransterTM-H4000试剂转染到丝腺组织中，48h后用荧光显微镜观察，培养基清澈，丝腺组织外形完好、发出亮绿色荧光，表明egfp在丝腺中得到了表达，离体培养丝腺组织进行基因瞬时表达是可行的。该方法的建立为研究蚕丝蛋白基因表达调控的分子机制提供新的技术途径，也为家蚕其他组织的体外培养和研究提供借鉴。 3、组织和个体水平证实miR-2805显著上调BmFib-L基因的表达 从NCBI中下载miR-2805的前体序列（pre-miR-2805）和BmFib-L3’UTR序列，分别构建pre-miR-2805的表达载体pcDNA3.0[ie1-egfp-pre-miR-2805-SV40]和BmFib-L3’UTR重组质粒pGL3.0[A3-luc-Fib-L-3'UTR-SV40]，共转染BmN细胞，检测miR-2805对BmFib-L调控功能；再用人工合成miR-2805的模拟物（mimic）和抑制物（inhibitor），进一步验证miR-2805的功能，结果显示，miR-2805在卵巢来源的BmN细胞中，通过与BmFib-L3'UTR结合负调控其表达。为了验证miR-2805在家蚕体内对BmFib-L表达的调控作用，分别采用5龄幼虫丝腺离体培养和体腔注射的方法，进行过表达或抑制内源性表达，荧光定量分析结果显示，miR-2805在离体培养丝腺和幼虫体内都具有显著上调BmFib-L表达的作用。 4、证实miR-2805通过上调BmAwh和Bmdimm的表达间接调控BmFib-L的表达 为了明确细胞和组织及个体水平差异的原因，根据NCBI数据库中转录因子（TF）SGF-1、SGF-3、MBF1、FMBP-1、BmAwh和Bmdimm的序列，设计引物；以上述个体注射处理幼虫RNA为模板，A3为内参，qRT-PCR技术定量分析了体内过表达miR-2805或抑制表达后，丝腺细胞特异性转录因子的表达水平。结果显示，miR-2805能促进BmAwh和Bmdimm的表达。而且生物信息学分析显示miR-2805能结合BmAwh的CDS区和Bmdimm的5’UTR。因此，我们推测miR-2805通过BmAwh和Bmdimm间接上调BmFib-L基因的表达。 5、体内体外实验证实miR-0031-3p抑制BmFib-L基因的表达 按照上述同样的方法，构建miR-0031-3p表达载体，并人工合成miR-0031-3p的mimic、mimic negative、inhibitor和inhibitor negative。在细胞水平进行过表达和抑制内源性表达验证，结果显示miR-0031-3p抑制BmFib-L基因表达。并进一步在组织水平进行抑制功能验证，将miR-0031-3p的inhibitor及其negative control转染到放有丝腺组织的培养孔中，荧光定量PCR检测靶基因BmFib-L的表达量。结果显示，inhibitor抑制miR-0031-3p的作用，促使BmFib-L的表达量上升，即miR-0031-3p能够下调BmFib-L的表达。采用5龄2d幼虫体腔注射方法进行体内验证，结果再次表明，miR-0031-3p抑制BmFib-L3’UTR基因的表达。 研究结果有利于深入理解家蚕miRNA的功能，为蚕丝蛋白表达调控分子机理提供新的实验数据。
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