摘要
随化石燃料地日益枯竭，利用生物法制备2,3-丁二醇的方式备受重视，其中利用非粮作物菊芋代替葡萄糖作为发酵碳源用于生物合成2,3-丁二醇是一个重要的研究方向，但菊芋块茎中的菊糖较难被微生物直接利用导致产物产量及生产强度较低，因此筛选合适的菌株、合理的优化发酵工艺对于以菊糖为主要碳源进行生物法制备2,3-丁二醇的整个过程至关重要。 首先，本实验筛选到一株能直接转化菊糖产2,3-丁二醇的单菌。固体培养时菌落形成时间短，表面光滑呈半球态，菌落较粘易形成拉丝，为革兰氏阴性菌，经16S rRNA鉴定确定其为肺炎克雷伯氏菌并命名为Klebsiella pneumoniae DL-H3。 然后，考察了菌种DL-H3所产菊粉酶的催化性能和影响因素。菌种DL-H3所产菊粉酶主要位于胞内，是一种外切型菊粉酶，其适宜的催化条件为pH6.0、30℃、以含2％菊糖的缓冲液为底物反应30min，发现各金属离子中K+与Mn2+对于菊粉酶的催化反应促进作用最强，各类试剂中琥珀酸与乙酸能抑制菊粉酶使其丧失活力，10种常见氮源中硫酸铵的添加使菌种DL-H3的总糖利用率达到最大值77.68％。 其次，对菊糖无法完全被利用的原因进行了研究。在培养基与培养条件的优化下（pH6.5、搅拌速率200r/min、通气速率0.2vvm、块茎浸提液中添加16.53g/L硫酸铵）总糖利用率达到86.98％，比未优化时提高20％左右，随发酵的进行发酵液中菊糖的平均聚合度由初始的2.82增大到结束时的8.08，菌种DL-H3所产的菊粉酶在发酵过程中能一直保持较高酶活，残糖中菊糖未被降解与利用的原因可能是随发酵的进行短链菊糖优先被摄取与利用，长链菊糖逐渐积累但无法被菌种DL-H3摄取进入细胞，阻断了酶解反应的发生，导致菊糖无法被完全利用。 再次，通过对菊糖先进行预处理再发酵的策略实现了菊糖的完全利用。使用硫酸调节发酵液的初始pH至3.00再进行高温灭菌，实现了菊糖的部分降解。经预处理后的绝大部分菊糖能被利用，并且菌种DL-H3具备耐受高浓度底物进行批次发酵的能力。通过优化供氧条件，菌种DL-H3在pH6.0、搅拌速率250r/min、通气速率0.2vvm、202.55g/L的底物浓度条件下进行批次发酵，目标产物（2,3-丁二醇+乙偶姻）的产量达80.83g/L，转化率为0.426g/g，生产强度为2.23g/(L*h)，具备工业化生产的潜质。 最后，利用乙酸乙酯/磷酸氢二钾体系对2,3-丁二醇和乙偶姻的分离进了研究，发现该体系更适合分离乙偶姻，在利用该体系对菌种DL-H3所产发酵液中2,3-丁二醇进行盐析萃取时，发酵液中杂质多导致乳化现象严重使得萃取效果差。
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