摘要
猴B病毒（Monkey B virus，即Macacine alphaherpesvirus 1），是一种人畜共患病病原，其在自然宿主猕猴中多呈良性经过，而感染人后可引起脑脊髓炎甚至死亡，是目前确定的35种非人灵长类疱疹病毒中唯一一种已知对人有致病性的病毒，也是我国实验动物微生物学等级及监测国家标准中普通级实验用猴应排除的病原微生物。而目前现有的猴 B 病毒检测方法存在与人单纯疱疹病毒有交叉反应、步骤繁琐或无法同时检测猴 B病毒所有基因型的问题，因此，亟需建立快速、特异、通用检测猴 B病毒的方法，对于相关人员暴露后的快速诊断和治疗以及对建立高质量的实验猴群均具有重要意义。 目的：建立能同时检测猴B病毒5种基因型的通用实时荧光定量PCR检测体系，并对其进行方法学评价。 方法：首先，通过文献调研，确定猴 B病毒的gB基因相对保守，从 GenBank上下载猴 B病毒 5种基因型代表株的gB基因序列，使用 DNAStar软件对这 5种基因型代表毒株进行比对，确定猴B病毒各基因型gB基因的相对保守位置，再将这些保守位置序列与人单纯疱疹病毒Ⅰ型（Herpes simplex virus type 1，HSV-1）、人单纯疱疹病毒Ⅱ型（Herpes simplex virus type 2，HSV-2）的代表株序列进行比对，最终确定碱基错配位置较多的gB基因保守区域设计了两套检测猴B病毒的通用引物和探针，分别为3号和 4 号通用引物探针检测体系。其次，将设计的两套引物探针进行合成，并分别对其针对 HSV-1、HSV-2的特异性进行初步评价。接着，为两套引物探针构建相应的猴 B病毒参考品质粒作为模板，对两套检测体系的反应体系（引物浓度、探针浓度、添加Mg2+浓度）和反应条件（退火温度）进行优化，确定了最佳反应体系和反应条件后，初步对其针对gB基因插入pUC19载体后构建的gB基因重组质粒的灵敏度进行评价，从中选取灵敏度较好的一套，建立实时荧光定量 PCR 检测体系的标准曲线，最后对其分别进行特异性、通用性、敏感性和重复性评价。 结果：3号、4号引物探针检测体系在检测 HSV-1、HSV-2时，均为阴性。3号引物探针检测体系的最佳反应体系为：Premix Ex TaqTM（Probe qPCR）10μL，探针终浓度为800 nmol/L，上游引物和下游引物终浓度为1000 nmol/L，添加MgCl2终浓度为3 mmol/L，模板 3 μL，加无菌去离子水至 20 μL；最佳反应条件为：95℃ 30 s；95℃ 5 s、58℃ 30 s，40个循环。4号引物探针检测体系的最佳反应体系为：Premix Ex TaqTM （Probe qPCR）10 μL，探针终浓度为 550 nmol/L，上游引物和下游引物终浓度为 800 nmol/L，模板 3 μL，加无菌去离子水至 20 μL；最佳反应条件为：95℃ 30 s；95℃ 5 s、62℃ 30 s，40个循环。再对 3号、4号引物探针检测体系针对猴 B病毒 gB基因重组质粒的灵敏度进行初步评价，发现 3 号引物探针检测体系的灵敏度优于 4 号。接着以 3 号引物探针检测体系建立标准曲线，该标准曲线在 1×107~1×102 copies/μL 模板范围内，相关系数为 R2=0.999。方法学评价结果显示，该实时荧光定量 PCR检测体系与HSV-1、HSV-2、水痘带状疱疹病毒、EB 病毒、巨细胞病毒均无交叉反应；该方法可同时检测猴 B 病毒 5种基因型，分别是恒河猴基因型、食蟹猴基因型、日本猕猴基因型、豚尾猴基因型和狮尾猴基因型；其检测恒河猴基因型猴 B 病毒的检测下限为 10 copies/μL；5次批内和5次批间实验重复性良好。 结论：本研究建立了猴 B病毒通用实时荧光定量 PCR检测体系，并对其进行了方法学评价，该检测体系针对同属疱疹病毒科的HSV-1和HSV-2具有良好的特异性、针对猴 B病毒 5种基因型具有良好的通用性、针对猴 B病毒具有敏感性高和重复性好的特点。为猴 B病毒实时荧光定量 PCR检测试剂盒的研发奠定了一定基础，对于临床疑似猴B病毒感染病例的辅助诊断以及猴 B病毒流行病学的深入研究，无猴 B病毒实验猴群的建立，均有着重要意义。
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