摘要
背景： 白癜风是一种色素脱失性疾病，临床主要表现为表皮黑素细胞的破坏和缺失，在世界不同种族、地域发生率为 0.5-2%，并且呈逐年上升趋势。然而目前白癜风表皮黑素细胞破坏的发病机制尚未完全阐明。目前白癜风发病机制仍存在多种理论，国内外学者普遍认为白癜风是一种多种因素共同参与的疾病，其中包括自身免疫、遗传、环境以及氧化应激等，这些因素共同作用导致白癜风的发病。氧化应激通常被认为是白癜风的始动因素。诸多证据显示白癜风患者全身或局部表皮中存在抗氧化功能缺陷，局部 ROS 蓄积，造成黑素细胞破坏。线粒体是细胞内 ROS 的主要来源。然而，目前关于白癜风氧化应激导致黑素细胞线粒体损伤的具体分子机制尚未充分阐明。因此，我们对黑素细胞线粒体氧化损伤的关键分子及作用机制进行深入研究，可为保护黑素细胞氧化损伤并寻找白癜风治疗新靶点提供理论依据。Sirt3 是NAD+依赖的去乙酰酶 Sirtuins 家族成员之一，其主要定位于细胞线粒体，可调控多种线粒体蛋白的乙酰化，进而发挥多种重要的生物学功能。Sirt3 能够调控细胞代谢和氧化应激，修复线粒体氧化损伤，抵抗线粒体介导的细胞凋亡，但具体的分子机制尚未阐明。既往研究表明，Sirt3 可以通过去乙酰化修饰重要的抗氧化酶 SOD2，增加其活性，降低细胞内的ROS水平；同时还可以通过去乙酰化修饰线粒体融合蛋白OPA1，维持线粒体动力学，从而对细胞发挥保护作用。因此，我们提出一个新的研究假说：Sirt3可通过去乙酰化修饰SOD2、OPA1等在保护线粒体功能抵抗黑素细胞氧化损伤中发挥重要作用；当该分子表达及活性发生异常时，可增强细胞线粒体氧化损伤，以致于线粒体依赖的细胞凋亡增加，诱导白癜风发生。 目的： 1. 明确Sirt3在对抗黑素细胞氧化损伤中的作用。 2. 探讨白癜风黑素细胞中Sirt3表达及活性异常的具体机制。 3. 阐明Sirt3保护线粒体对抗黑素细胞氧化应激损伤的分子机制。 方法： 1. 应用免疫荧光检测进展期白癜风组织和正常健康皮肤组织中 8-OHdG、Sirt3 及Ace-SOD2的表达，并进行量化分析。 2. 应用 H2O2分别处理原代黑素细胞 NHEM 及正常黑素细胞系 PIG1，RT-PCR 和Western blot 检测 Sirt3 mRNA 水平和蛋白水平的表达；比较 H2O2 刺激前后Ace-SOD2/SOD2比值，以对比Sirt3去乙酰化酶活性。 3. 应用Sirt3基因siRNA干涉NHEM细胞中Sirt3的表达，并进行H2O2处理，应用流式细胞术检测细胞凋亡，线粒体内膜ROS及线粒体膜电位水平，并进行比较；同时应用Western blot检测凋亡相关分子（PARP，Bax，Bcl-2，caspase-9）的表达。 4. 分别在正常人黑素细胞系PIG1和白癜风黑素细胞系PIG3V中检测H2O2处理前后Sirt3的表达及去乙酰化底物Ace-SOD2/SOD2比值，并进行比较，以检测Sitr3去乙酰化酶活性变化；此外，分离 PIG1 和 PIG3V 细胞线粒体，提取线粒体蛋白，检测H2O2处理前后线粒体乙酰化水平的改变。 5. 在PIG1和PIG3V中分别检测H2O2处理前后脂质过氧化产物MDA和4-HNE的变化；利用氧化修饰羰基化检测试剂盒在PIG1和PIG3V中检测H2O2处理前后细胞总的羰基化水平变化；应用RT-PCR和Western blot检测H2O2处理前后PGC1α的表达，并应用免疫荧光检测正常人皮肤组织和白癜风组织中PGC1α的表达；利用siRNA干涉PGC1α的表达后检测Sirt3 mRNA水平和蛋白水平的表达。 6. 应用siRNA干涉PIG1中Sirt3的表达，H2O2处理后，分离细胞线粒体，并提取制尚未阐明。既往研究表明，Sirt3 可以通过去乙酰化修饰重要的抗氧化酶 SOD2，增加其活性，降低细胞内的ROS水平；同时还可以通过去乙酰化修饰线粒体融合蛋白OPA1，维持线粒体动力学，从而对细胞发挥保护作用。因此，我们提出一个新的研究假说：Sirt3可通过去乙酰化修饰SOD2、OPA1等在保护线粒体功能抵抗黑素细胞氧化损伤中发挥重要作用；当该分子表达及活性发生异常时，可增强细胞线粒体氧化损伤，以致于线粒体依赖的细胞凋亡增加，诱导白癜风发生。 目的： 1. 明确Sirt3在对抗黑素细胞氧化损伤中的作用。 2. 探讨白癜风黑素细胞中Sirt3表达及活性异常的具体机制。 3. 阐明Sirt3保护线粒体对抗黑素细胞氧化应激损伤的分子机制。 方法： 1. 应用免疫荧光检测进展期白癜风组织和正常健康皮肤组织中 8-OHdG、Sirt3 及Ace-SOD2的表达，并进行量化分析。 2. 应用 H2O2分别处理原代黑素细胞 NHEM 及正常黑素细胞系 PIG1，RT-PCR 和Western blot 检测 Sirt3 mRNA 水平和蛋白水平的表达；比较 H2O2 刺激前后Ace-SOD2/SOD2比值，以对比Sirt3去乙酰化酶活性。 3. 应用Sirt3基因siRNA干涉NHEM细胞中Sirt3的表达，并进行H2O2处理，应用流式细胞术检测细胞凋亡，线粒体内膜ROS及线粒体膜电位水平，并进行比较；同时应用Western blot检测凋亡相关分子（PARP，Bax，Bcl-2，caspase-9）的表达。 4. 分别在正常人黑素细胞系PIG1和白癜风黑素细胞系PIG3V中检测H2O2处理前后Sirt3的表达及去乙酰化底物Ace-SOD2/SOD2比值，并进行比较，以检测Sitr3去乙酰化酶活性变化；此外，分离 PIG1 和 PIG3V 细胞线粒体，提取线粒体蛋白，检测H2O2处理前后线粒体乙酰化水平的改变。 5. 在PIG1和PIG3V中分别检测H2O2处理前后脂质过氧化产物MDA和4-HNE的变化；利用氧化修饰羰基化检测试剂盒在PIG1和PIG3V中检测H2O2处理前后细胞总的羰基化水平变化；应用RT-PCR和Western blot检测H2O2处理前后PGC1α的表达，并应用免疫荧光检测正常人皮肤组织和白癜风组织中PGC1α的表达；利用siRNA干涉PGC1α的表达后检测Sirt3 mRNA水平和蛋白水平的表达。 6. 应用siRNA干涉PIG1中Sirt3的表达，H2O2处理后，分离细胞线粒体，并提取线粒体蛋白，同时提取细胞浆蛋白，利用Western blot实验检测线粒体Cytochrome c的胞浆释放；并应用电镜观察线粒体形态变化，免疫荧光检测线粒体融合裂解改变；应用Sirt3过表达质粒转染PIG3V，H2O2处理后，检测线粒体Cytochrome c的胞浆释放，观察线粒体形态变化，线粒体融合裂解改变，并用流式细胞术检测细胞凋亡水平、线粒体内膜活性氧水平以及线粒体膜电位水平。 7. 应用siRNA干涉PIG1中Sirt3的表达，H2O2处理后，Western blot检测线粒体融合蛋白（线粒体外膜的MFN1、MFN2和线粒体内膜的OPA1）以及线粒体裂解蛋白（DRP1）的表达，Co-IP检测OPA1 的乙酰化水平改变；在干涉Sirt3的情况下，回复OPA1的表达，进行H2O2处理，应用流式细胞术检测细胞凋亡和线粒体膜电位水平，免疫荧光检测线粒体融合裂解改变；Western blot检测PARP，Bax，Bcl-2，caspase-9等凋亡相关分子的表达；分离胞浆和线粒体蛋白，Western blot检测线粒体Cytochrome c的胞浆释放。 8. 应用Sirt3特异性激动剂和厚朴酚处理PIG3V细胞，并进行H2O2处理，cck-8检测细胞活力变化；Western blot检测Sirt3的表达及去乙酰化底物Ace-SOD2/SOD2比值，并进行比较，以对比Sirt3的表达和去乙酰化酶活性变化；流式细胞术检测细胞凋亡和线粒体膜电位改变；免疫荧光检测干涉 OPA1 条件下细胞线粒体动力学的改变；Western blot检测干涉OPA1条件下细胞凋亡相关分子的表达和线粒体cyto.c的胞浆释放。 结果及意义： 1. 同正常健康皮肤组织相比，进展期白癜风患者组织中氧化应激 DNA 损伤产物8-OHdG表达明显上调，Sirt3表达显著下调，与之相反，Ace-SOD2的表达显著上调，提示白癜风中Sirt3表达及活性异常，且与氧化应激密切相关。 2. H2O2处理原代黑素细胞NHEM及正常黑素细胞系PIG1后，Sirt3 mRNA和蛋白水平的表达均显著上调，Ace-SOD2/SOD2比值明显降低，提示氧化应激下正常黑素细胞Sitr3表达及去乙酰化酶活性增强。 3. 在原代黑素细胞NHEM中干涉Sirt3的表达后，H2O2处理条件下，细胞凋亡率显著升高，线粒体内膜 ROS 水平增加，线粒体膜电位水平降低；同时凋亡相关分子（cleaved-PARP，Bax 和 cleaved-caspase9）表达上调，抗凋亡蛋白（Bcl-2）表达下调，提示氧化应激下sirt3 能够保护黑素细胞线粒体功能，对抗细胞凋亡。 4. 白癜风黑素细胞系PIG3V进行H2O2处理后Sirt3的表达没有明显改变，去乙酰化底物Ace-SOD2/SOD2比值较正常黑素细胞系PIG1明显增加，提示其去乙酰化酶活性降低；此外，同PIG1相比，PIG3V细胞在H2O2处理后线粒体乙酰化水平显著增加，提示白癜风黑素细胞中氧化应激下存在Sirt3的激活障碍。 5. H2O2处理后PIG3V中MDA和4-HNE水平较PIG1细胞显著增加，总的羰基化水平显著上调；H2O2诱导PIG1细胞中Sirt3 转录因子PGC1α表达上调，而PIG3V无明显改变，并在白癜风组织中发现PGC1α的表达明显下调；此外，在PIG1细胞水平发现PGC1α可调控Sirt3的表达。提示氧化应激下白癜风黑素细胞中Sirt3的表达受到其转录因子 PGC1α 调控，并且其表达异常可能是由于脂质过氧化产物 4-HNE介导的羰基修饰导致的。 6. 氧化应激下，在PIG1细胞中干涉Sirt3的表达会增加线粒体损伤和细胞凋亡，而在PIG3V中过表达Sirt3则可以显著抑制细胞线粒体损伤和细胞凋亡，进一步研究提示Sirt3可以通过维持线粒体结构和线粒体动力学平衡，保护线粒体功能，从而抵抗线粒体氧化损伤诱导的细胞凋亡。 7. 在PIG1中干涉Sirt3的表达，氧化应激下，线粒体融合蛋白MFN1、MFN2和OPA1以及线粒体裂解蛋白DRP1表达无明显改变；Co-IP结果显示，干涉Sirt3的表达可以显著增加氧化应激下OPA1的乙酰化水平；OPA1回复实验结果显示，氧化应激下， Sirt3可通过OPA1-Cytochrome c途径维持线粒动力学平衡，保护线粒体功能并减少细胞凋亡。提示氧化应激下，Sirt3能够通过去乙酰化OPA1保护黑素细胞线粒体功能，对抗细胞凋亡。 8. Sirt3特异性激动剂和厚朴酚可以通过激活Sirt3-OPA1途径对氧化应激下白癜风黑素细胞具有明显的保护作用。 结论： 通过本课题研究，我们首次明确了线粒体去乙酰化酶Sirt3在白癜风黑素细胞氧化损伤中的作用，并发现在氧化应激条件下，白癜风黑素细胞中存在Sirt3激活障碍，阐明了氧化应激下白癜风黑素细胞 Sirt3 的表达及活性异常的具体机制，以及 Sirt3能够通过去乙酰化OPA1保护黑素细胞线粒体功能，对抗细胞凋亡的具体分子机制，预期结果将有助于深入认识氧化应激调节黑素细胞死亡的具体机制，为白癜风的治疗提供全新策略和关键靶点。
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