摘要
刺梨(Rosa roxburghii Tratt.)因其果实富含维生素C(L-Ascorbic acid, AsA)而备受关注。本课题组前期研究表明L-半乳糖途径可能是其果实 As A合成的主要途径，而参与该途径的GDP–L–半乳糖磷酸化酶(GDP-L-galactose phosphatase，GGP)可能是其关键酶（关键基因）。本研究以‘贵农 5 号’ (‘Guinong 5’) 刺梨为材料，采用染色体步移法(chromosome walking)克隆了刺梨GGP基因的全长gDNA序列和启动子序列，分析了其结构特点和组成原件，并通过双荧光素酶报告基因检测系统检测了各（缺失）元件的活性；在此基础上，验证了光照、温度以及部分外源激素对该基因的表达调控响应。获得的主要结果如下： 1、通过PCR技术从刺梨果实中克隆出了刺梨GGP基因gDN A序列，其全长序列为2103bp，包含4个外显子和3个内含子，内含子分别位于1007-1092bp、1277-1404bp和1652-1744bp之间，共304bp。利用染色体步移法克隆了刺梨GGP基因启动子的序列，其长度为2133bp。启动子顺式作用元件在线分析显示GGP基因启动子序列主要包括：光响应相关的顺式作用元件、逆境响应元件、激素响应元件以及组织特异元件等。 2、构建瞬时表达载体，以烟草叶片为宿主材料，运用双荧光素酶报告基因检测系统检测启动子的启始活性。结果显示，刺梨 GGP 基因启动子的活性远高于缺失体的活性，推测-1949到-2089bp之间可能存在增强子区域，并且这140 bp对启动子的活性具有重要作用。此外，启动子缺失体实验研究表明，在-1220到-1386之间可能存在负调控元件，造成缺失体 QSF3 的启始活性突然升高。光照、高温均能诱导 GGP 基因启动子的活性。根据刺梨 GGP 基因启动子缺失体对不同处理的响应情况，推测 CAG-motif、GA-motify与 G-Box可能在光暗响应中发挥着极为重要的作用；高温响应元件 HSE对启动子的启始活性有正调控作用，还可能含有未知的温度调控元件；TGACG-motif在刺梨GGP基因启动子对茉莉酸甲酯(methyl jasmonate, MeJA)的响应中发挥着重要作用。 3、响应元件验证实验表明，光照处理诱导G GP基因启动子的活性，使得GG P基因表达上升，进而提高刺梨果肉的AsA含量，而黑暗处理抑制GGP基因启动子的活性，使得刺梨果肉GGP基因表达下调，AsA含量急剧降低；42℃高温处理使得GGP基因表达量下调，能够明显的降低刺梨果肉的 As A 含量，而 4℃低温处理则相反；脱落酸(Abscisic Acid, ABA)与MeJA处理对GGP基因启动子缺失体的活性起到抑制作用，且GGP基因的表达都存在降低的趋势，但ABA处理使得AsA含量上升，MeJA处理则降低了刺梨果实中AsA含量。
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