摘要
背景 近年来骨质疏松症的发病率随着人口老龄化程度加深而不断上升。骨质疏松性骨折是其最为危险的后果，其高致残致死率不但严重威胁患者的生存时间和生存质量，同时给个人的家庭和社会医疗保障造成沉重的心理和经济负担。因此，对骨质疏松发病机制的研究是当前一个尤为紧迫的课题。Hedgehog信号通路在骨骼的发生发育过程中发挥着重要的调节作用，其信号强度异常常会引发各种疾病。Hedgehog信号通路在骨质疏松中的作用也得到了广泛的研究。研究发现Hedgehog信号通路促进体内和体外成骨细胞的增殖分化以及骨形成能力。并且其在体内可通过调节成骨细胞分泌RANKL与OPG的比值高低，间接调控破骨细胞，从而对整体的骨量产生影响。然而，与对Hedgehog信号通路调控成骨细胞机制的充分研究相比，Hedgehog信号通路对破骨细胞的研究较为匮乏，目前仅有体外研究数据证实Hedgehog信号通路对破骨细胞的增殖分化以及骨吸收能力产生正向调控，而Hedgehog信号通路对体内破骨细胞是否同样发挥正向的调控作用，以及对整体骨量有何影响仍然是悬而未决的问题。 目的 研究Hedgehog信号通路在体内破骨细胞中发挥的作用，观察其对整体骨量的影响，并研究其机制，从而为骨质疏松的治疗提供参考。 方法 1．构建体内破骨细胞中特异性上调或抑制Hedgehog信号通路的基因工具小鼠模型。通过使用基因敲入技术获得的 CTSK-Cre 基因工具小鼠，分别与使用转基因技术使PTC位点被LoxP标记的PTC(F/F)基因工具小鼠以及SMO位点被LoxP标记的SMO(F/F)基因工具小鼠杂交，获得体内破骨细胞中特异性上调Hedgehog信号通路的CTSK-Cre；PTC(F/F)小鼠，以及体内破骨细胞中特异性抑制Hedgehog信号通路的CTSK-Cre；SMO(F/F)小鼠。确保其是否能正常繁育无胚胎致死性，以便用于后续试验观察。 2．通过观察实验组 CTSK-Cre；PTC(F/F)小鼠与对照组 PTC(F/F)小鼠，或实验组 CTSK-Cre；SMO(F/F)小鼠与对照组 SMO(F/F)小鼠骨量，观察特异性调节破骨细胞内Hedgehog信号通路对体内破骨细胞及整体骨量的影响。小鼠生长至观测时间点，取材固定，通过显微 CT 扫描评估整体骨量。制作组织切片进行 TRAP 染色观察体内破骨细胞的数目变化。荧光双标、I型胶原免疫组织化学染色观察成骨细胞成骨能力。血清骨吸收骨形成标志物检测评估小鼠骨转换状态。 3．获得实验组CTSK-Cre；SMO(F/F)小鼠与对照组SMO(F/F)小鼠骨髓单核细胞进行体外实验。通过细胞增殖、破骨细胞诱导、骨磨片吸收实验以及细胞总RNA的提取，观察 Hedgehog 信号通路对体外破骨细胞增殖分化以及骨吸收的调节功能。通过破骨细胞-成骨细胞共培养实验，检测成骨细胞的RNA表达以及茜素红、ALP 染色，观察 Hedgehog 信号通过调控破骨细胞发挥的对成骨细胞的间接调控作用。筛选破骨细胞调控成骨细胞的相关因子，RT-PCR 检测其表达情况，寻找Hedgehog通过破骨细胞影响成骨细胞的作用因子。 结果 1．成功获取在体内特异性调节破骨细胞中Hedgehog信号通路的CTSK-Cre；PTC(F/F)小鼠、CTSK-Cre；SMO(F/F) 小鼠。小鼠能够正常出生，出生性别比例以及基因型比例符合孟德尔遗传学规律。 2．完全敲除体内破骨细胞PTC基因后实验组CTSK-Cre；PTC(F/F)小鼠体内骨量减少明显，在其股骨骨干有自发性骨折出现，活动受限。体内破骨细胞数量明显增加，成骨细胞细胞分泌 I 型胶原能力有所增强。由于缺乏营养支持等原因， CTSK-Cre；PTC(F/F)小鼠会在10天左右死亡，因此我们观察半敲除破骨细胞内PTC基因即 CTSK-Cre；PTC(F/+)小鼠，观察体骨吸收和骨形成的变化，发现半敲除破骨细胞内PTC基因对小鼠的破骨细胞以及整体骨量的影响不明显。 3．完全敲除体内破骨细胞SMO基因的实验组CTSK-Cre；SMO(F/F)小鼠体内骨量下降，而我们发现实验组小鼠破骨细胞是减少的，同时小鼠成骨细胞的成骨能力明显下降，骨吸收骨形成标志物的检测表明实验组小鼠骨转化速率降低。由于我们仅抑制了破骨细胞中的Hedgehog信号通路，不难看出这些结果表明，由于破骨细胞骨吸收下降，引起成骨细胞骨形成能力下降，即Hedgehog信号通路通过调控破骨细胞发挥了对成骨细胞的间接调节作用。 4．体外研究结果表明，抑制 Hedgehog信号通路对体外骨髓单核细胞的增殖没有明显影响，但是诱导破骨细胞的分化明显受损，RT-P C R表明多种与破骨细胞分化融合的基因表达降低。虽然实验组小鼠可形成正常的伪足带，但是骨吸收骨磨片实验结果表明实验组破骨细胞的骨吸收能力下降。通过破骨细胞与成骨细胞共培养实验，我们发现，实验组成骨细胞表达的成骨细胞特异性因子明显降低，茜素红以及ALP结果显示成骨细胞骨形成能力明显降低。对破骨细胞调控成骨细胞的相关因子进行的 RT-PCR 检测结果显示，破骨细胞分泌的成骨细胞诱导因子明显下降。 结论 综上所述，我们发现Hedgehog信号通路在体内破骨细胞中发挥重要的调控作用。单纯对破骨细胞而言，在体内上调其Hedgehog信号通路会增加破骨细胞的数目并增强其骨吸收功能，而下调Hedgehog信号通路会减少破骨细胞数目并使其骨吸收功能减弱，这与体外实验相一致。而对整体骨量而言，当完全敲除体内破骨细胞内Hedgehog信号通路后，破骨细胞骨吸收活跃，使骨重建平衡破坏严重，严重破坏的骨质使小鼠自发骨折出现，危及小鼠生存。当抑制体内破骨细胞Hedgehog信号通路时，在抑制骨吸收的同时，成骨细胞的骨形成能力也明显下降，骨重建处于负平衡，最终小鼠骨量降低。结合体外的数据表明，Hedgehog信号通路对破骨细胞有正向调控作用，而且通过调控破骨细胞表达成骨细胞诱导因子，发挥对成骨细胞的间接调控作用。本研究提示，进一步寻找破骨细胞分泌的成骨细胞诱导因子，为临床预防和治疗骨质疏松症提供了可能。
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