摘要
弓形虫是一种机会性致病性原虫;患病宿主在免疫力不足或缺陷时会出现严重症状甚至死亡。但是目前还没有完全有效的防治弓形虫病的策略。弓形虫有多种基因型;在我国流行的优势基因型是Chinese I（ToxoDB#9）型。尽管不同基因型弓形虫在DNA序列上的差异仅有1-2%;但是它们对小鼠的急性毒力却存在明显的差异。然而弓形虫毒力差异形成机制尚不完全清楚。因此;本研究从基因组和转录组水平上来探究弓形虫不同基因型之间的毒力差异形成的机制。其次;在人和动物体内 II 型虫株流行最为广泛;接下来我们采用基于液相色谱－质谱联用技术(LC-MS/MS)的非靶向代谢组学研究方法;对 II 型弓形虫感染小鼠肝脏、脾脏后的代谢变化进行了研究。主要研究结果如下： （1）将不同基因型（Type I; RH虫株;Type II; Pru虫株;Type III; VEG虫株;ToxoDB#9; C7及PYS虫株）弓形虫在HFF细胞上进行传代培养;收获并纯化大量弓形虫速殖子。通过限制性片段多态性实验及显微镜观察证实不同型弓形虫纯化效果很好。另外;通过动物实验;验证了不同基因型弓形虫毒力大小依次为RH>C7>PYS>Pru>VEG。 （2）对弓形虫不同基因型虫株进行基因组重测序发现：RH、C7、PYS、Pru、VEG各虫株间存在着大量的基因变异;SNP总数分别为443748、14611、290899、287317和274787;InDel总数分别为37313、2398、28118、18591和17524;SV总数分别为1155、860、904、1126和1028;CNV总数分别为818、1468、752、2629和2240。从5株弓形虫的SNP、InDel、SV和CNV数目来看;SNP和InDel是弓形虫基因组多样性的主要来源。RH与Pru的差异最明显;而PYS和C7的差异最不明显。RH和VEG的SV和CNV较少。Pru、PYS和C7的SV和CNV相对较多;且具有一定的相似度。虫株间特有的 SNP 和 InDel 主要分布在外显子（exons）、内含子（introns）和基因间（intergenic regions）;内含子区域最多;相对外显子的变异较少。对弓形虫毒力相关基因进行多态性比较分析发现;不同基因型虫株在已报道的毒力基因上均存在变异;其中棒状体颈部蛋白（RONs）编码基因上的变异最多。 （3）应用RNA-Seq技术;对不同基因型弓形虫速殖子进行了转录组测序;鉴定出不同基因型虫株间存在着大量的差异表达基因。RH虫株与其他虫株转录水平差异都比较明显;其中与PYS虫株基因表达差异最为明显。相对来说;PYS和C7虫株在基因表达上差异是最小的;这也说明转录水平与基因组水平具有正 相关性。相关毒力基因在RH vs PYS中表达差异最为显著;在C7 vs PYS中表达差异最不显著。对差异基因进行功能注释和通路分析;发现了很多差异表达基因参与了复制、转运和氨基酸合成通路等生物学过程。这些基因可能与弓形虫的毒力相关;可作为研究弓形虫毒力差异形成机制研究的候选基因。 （4）首先我们成功构建了急性和慢性感染期的小鼠感染模型。其次;应用LC-MS/MS技术对弓形虫感染小鼠的肝脏、脾脏进行代谢组学分析;检测到了在感染过程中肝脏、脾脏中存在的大量差异表达的代谢物和受干扰的代谢通路。在弓形虫感染的小鼠肝脏、脾脏中;受影响的代谢通路主要包括初级胆汁酸生物合成、鞘脂类代谢、类固醇生物合成、类固醇激素生物合成、花生四烯酸代谢等。比较急性感染期与慢性感染期发现;花生四烯酸代谢通路在这两个感染期呈现相反的表达趋势。这是由于宿主的免疫调节和炎症反应造成的;与这两个感染期弓形虫的存在形式相关。这些发现表明;弓形虫感染诱导了小鼠肝脏、脾脏代谢组的改变;为阐明弓形虫感染不同时期宿主代谢变化的机制提供了新的见解。 综上所述;本研究从基因组水平和转录组水平上对弓形虫不同基因型虫株之间的差异进行了初步探讨;发现了不同基因型虫株之间存在着大量的基因变异;这些基因变异很多发生在毒力基因上。在转录水平上;弓形虫不同基因型虫株之间也存在着大量的差异表达基因;这些差异基因部分是毒力相关基因;部分参与与毒力调节相关的通路。这些结果为探究不同基因型弓形虫虫株之间的毒力差异形成机制提供了理论依据。对弓形虫感染小鼠的肝脏、脾脏进行的代谢组研究发现;感染后的肝脏、脾脏中存在大量的差异表达代谢物;并且这些差异代谢物参与了多种重要的生物学活动。本论文所提供的数据能够加深我们对弓形虫感染的病理生理学的分子机制的了解;同时也能更好地帮助我们了解弓形虫感染与疾病相关的分子变化;对探索改善弓形虫病治疗和诊断的新途径也具有重要意义。
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