摘要
Bursicon是调节昆虫表皮硬化及展翅的激素类蛋白，它在昆虫的表皮硬化和翅的伸展过程中起着关键作用。本研究克隆获得烟蚜 Myzus persicae (Sulzer)。Bursicon基因（Burs-α和Burs-β）全长并预测其结构和功能，对这两个基因的进化地位进行分析；通过实时定量PCR（real-time quantitative PCR，q-PCR）技术研究了Bursicon基因在烟蚜不同发育阶段的表达特征，最后利用RNA干扰技术研究Bursicon基因在烟蚜体内的功能。相应结果如下： 1. 烟蚜不同翅型转录组分析 为了丰富烟蚜转录组数据信息，为探明烟蚜翅型分化的分子机制打下基础。本研究利用高通量测序技术Illumina HiSeqTM 2000分别检测烟蚜若蚜、无翅成蚜和有翅成蚜转录组表达差异；通过荧光定量 PCR 方法，分析翅型相关基因表达模式。结果表明：经过测序获得质量值高于20的碱基比例(Q20)均不低于94%的数据（GenBank登录号：SRR6112438, SRR6112436和SRR6112437）；所有reads组装成128 065个unigenes，平均长度607.08 bp；将所得序列注释到NR, NT, KOG, GO和KEGG等数据库进行比对，共有128 065个unigenes被注释。基因表达分析发现，与无翅成蚜和若蚜两者相比，有翅成蚜翅形成、肽类激素和受体蛋白相关基因的表达量存在显著差异。qPCR分析结果显示，在有翅成蚜与无翅成蚜中， Bursicon (Bur-α 和 Bur-β), Flightin (Fln), Wntless (Wnt), Distal-less (Dll), Decapentaplegic (Dpp), Juvenile hormone epoxide hydrolase 基因(JHEH)和Ecdysone receptor基因(EcR) 表达量存在显著差异，表明这些基因可能与翅型发育有关。 2. 烟蚜 Bursicon基因全长序列的获得 利用RT-PCR（reverse transcription PCR，RT-PCR）和cDNA末端快速扩增（rapid-amplification of cDNA ends，RACE）技术进行Bursicon基因进行全长扩增，序列经过DNAstar 5.0拼接得到848 bp Burs-α（GenBank登录号：MF083566）全长cDNA序列和841 bp Burs-β（GenBank登录号：MF083567）全长cDNA序列，将其分别命名为 Mpburs-α 和 Mpburs-β。分析表明，Mpburs-α 全长 cDNA序列拥有一个完整483 bp的开放阅读框（ORF），共编码160个氨基酸，5端非编码区（5'-UTR）63 bp，3端非编码区（3'-UTR）302 bp，具有真核生物典型加尾信号（AATAAA）和polyA结构；Mpburs-β的全长cDNA序列拥有一个完整417 bp的开放阅读框（ORF），共编码138个氨基酸，5端非编码区（5'-UTR） 124 bp，3端非编码区(3'-UTR) 300 bp，同样具有典型的加尾信号（AATAAA）和polyA结构。 3. 烟蚜 Bursicon基因生物信息学分析 对Mpburs-α和Mpburs-β基因全长序列分析，对Mpburs-α和Mpburs-β基因码的氨基酸及蛋白质进行理化性质和高级结构的生物信息学进行预测分析，结如下：Mpburs-α和Mpburs-β的相对分子量分别约为 17.59 kDa和15.45 kDa，别由2424个和2148个原子组成，估测理论等电点pI分别为7.96和4.84，化分子式分别为 C759H1204N210O232S19 和 C672H1072N180O212S12；Mpburs-α 和pburs-β的氨基酸序列与豌豆蚜Acyrthosiphon pisum和麦双尾蚜Diuraphis noxia化激素氨基酸序列一致性最高；Mpburs-α 和 Mpburs-β 基因均有没有跨膜区，都具有信号肽和磷酸化位点；分子系统进化树分析表明，烟蚜与豌豆蚜和麦双蚜亲缘关系较近。 4. 烟蚜 Bursicon基因不同龄期表达分析 利用荧光定量 PCR 技术分析烟蚜在不同发育时期 (1 龄若虫至刚羽化的成虫)的Mpburs-α和Mpburs-β基因的表达模式。结果显示，Mpburs-α和Mpburs-β基因在烟蚜不同发育阶段表达量不同。其中1龄若蚜表达量最高，4龄若蚜最低。有翅型1日龄成蚜与无翅型相比，Mpburs-α和Mpburs-β基因在有翅型成蚜中表达量均显著高于无翅型成蚜。 5.烟蚜 Bursicon基因功能分析 分别用dsburs-α、dsburs-β和Pbs饲喂烟蚜2龄若虫，观察记录表型变化和死亡率，72 h后收集部分虫体检测靶标基因在烟蚜体内表达情况。结果显示，与饲喂Pbs相比，饲喂dsburs-α和dsburs-β后，Burs-α基因和Burs-β基因在烟蚜体内的表达水平分别下降了 67.54%和50.46%，说明Burs-α基因和Burs-β基因的表达明显被抑制。 死亡率统计及表型观察发现：当饲喂dsMpburs的最终浓度为15 ng/μl，72h时实验组与对照组的死亡率没有明显差异，但表皮的颜色异常，由红褐色变为淡绿色或透明状，表皮黑化程度明显降低。说明饲喂dsMpburs基因后烟蚜表皮鞣化和黑化作用受到抑制。 本文通过烟蚜转录组测序、设计特异性引物、RT-PCR技术、RACE 技术成功获得了烟蚜鞣化激素-α和鞣化激素-β基因全长序列，并利用荧光定量 PCR 以及 RNAi 技术，研究了它们在烟蚜不同发育时期的表达量变化情况以及在烟蚜生长发育过程中所起的作用，以期为进一步研究烟蚜鞣化激素基因的功能打下基础，为研究以鞣化激素为靶标的新型防治技术提供借鉴。
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