摘要
目的：非同源末端连接(non-homologous end joining，NHEJ)是真核细胞应对DNA双链断裂(DNA double-strand break, DSB)的主要修复方式。肿瘤细胞NHEJ修复能力的提高与其放化疗抵抗有关，抑制肿瘤细胞 NHEJ 修复，能够显著增加肿瘤对放化疗的敏感性。目前国内外有关 DSB修复抑制剂在实体肿瘤放化疗增敏中的临床应用尚未见报道。本课题拟应用基因组定点编辑技术—规律成簇的间隔短回文重复序列及其系统（CRISPR/CRISPR associated system, Cas9）以及高分辨熔解曲线（high-resolution melting，HRM)分析技术构建一种检测 NHEJ 修复活性的体系，在此基础上高通量筛选新型NHEJ修复抑制剂。联合X射线照射观察候选小分子化合物对肿瘤细胞放射敏感性及DSB修复能力的影响，进一步阐明候选NHEJ抑制剂调控DSB修复的机制。 方法：(1)设计并构建打靶 HPRT 及 HBEGF 基因的 Cas9/gRNA 质粒，将Cas9+sgHPRT质粒转染HEK293T细胞，应用普通PCR扩增打靶片段，通过Sanger测序、T7E1 酶切实验、琼脂糖凝胶电泳检测 CRISPR/Cas9 系统定点诱导的 DSB所致的NHEJ修复活性；基于加入新型饱和染料EvaGreens的荧光定量PCR反应体系对含有突变位点的DNA片段进行扩增，通过高分辨熔解曲线分析技术观察比较 Cas9 空白质粒转染组与 Cas9+sgHPRT 质粒转染组熔解曲线的差异，运用熔解曲线减法运算量化 CRISPR/Cas9 系统定点诱导的 DSB 所致的 NHEJ 修复效率（△Fmax）；将不同质量的Cas9+sgHPRT质粒转染HEK293T细胞24h后提取细胞基因组，应用荧光定量 PCR 扩增打靶片段，观察 HRM 分析能否定量检测CRISPR/Cas9系统诱导的NHEJ修复活性。 （2）将Cas9+sgHPRT和Cas9+sgHBEGF质粒分别转染HEK293T细胞、Hela细胞及T98G细胞，从6种（2×3）基因突变方案中择优作为最终的药物筛选打靶方案；将CRISPR/Cas9质粒转染细胞5h后予以不同浓度的DNA-PK抑制剂NU7441和KU-0060648处理细胞24h后提取细胞基因组，通过荧光定量PCR扩增打靶片段，运用高分辨熔解曲线分析验证该 NHEJ 修复抑制剂筛选体系的可靠性和灵敏度；将CRISPR/Cas9质粒转染细胞5h后予以1540种小分子化合物处理24h，利用 Chelex-100 法提取细胞基因组，应用高分辨熔解曲线分析技术检测不同小分子化合物处理对CRISPR/Cas9系统诱导的细胞NHEJ修复活性的影响，筛选出荧光差值△Fmax低于10的候选NHEJ抑制剂。 （3）利用细胞增殖-毒性检测实验进一步筛选细胞毒性相对较小的候选小分子化合物，通过克隆存活实验观察候选NHEJ抑制剂对人宫颈癌细胞Hela和人脑胶质瘤细胞T98G放射敏感性的影响；通过中性彗星电泳、细胞免疫荧光实验及细胞周期检测分析候选NHEJ抑制剂对X射线照射所致肿瘤细胞DSB修复能力的影响；利用eGFP-NHEJ/HR荧光报告系统验证候选药物对NHEJ和HR修复活性的影响，通过western blot技术、DNA-PK激酶检测实验进一步探讨其调控DNA双链断裂修复的作用机制。 结果：（1）高分辨熔解曲线分析技术可以定量检测 CRISPR/Cas9 诱导的定点突变。T7E1酶切实验显示：HPRT基因突变位点发生了碱基突变，能够被T7核酸内切酶I切割成大小为130bp和270bp的两个片段；Sanger测序显示在打靶位点出现了套峰，进一步证实了Cas9+sgHPRT质粒在HEK293T细胞基因组中成功定点诱导了NHEJ修复（定点突变）；HRM分析结果显示，与Cas9空白质粒转染组相比，Cas9+sgHPRT 质粒转染组的熔解曲线存在显著差异，通过熔解曲线减法运算得到每个熔解温度下 Cas9+sgHPRT 质粒转染组与 Cas9 空白质粒转染组的荧光数据差值△F。以 △F（荧光差异）作为评估打靶位点突变效率的指标，以△Fmax （荧光差异最大值）作为突变位点NHEJ修复效率的量化指标；将Cas9空白质粒和Cas9+sgHPRT质粒以不同的比例混合，转染HEK293T细胞后诱导出不同的突变效率（0%、25%、50%、60%、70%、80%、90%、100%），HRM分析结果显示△F 随着突变效率的增高而逐渐增加，且 In（△Fmax）与突变效率呈良好的线性关系（R2=0.957）。 （2）1540种小分子化合物筛选结果分析。HRM分析结果显示：在6种（2×3）打靶方案中，Cas9+sgHPRT 质粒转染 HEK293T 细胞所诱导的 NHEJ 修复效率（△Fmax）最高，在后续NHEJ抑制剂筛选体系中，△Fmax值的增加有助于提高筛选体系的灵敏度和分辨率，因此最终选择Cas9+sgHPRT质粒转染HEK293T细胞作为后续药物筛选实验的打靶方案；通过不同浓度的 DNA-PK 抑制剂 NU7441和KU-0060648抑制Cas9+sgHPRT质粒所诱导的NHEJ修复，HRM分析结果显示△F随着NU7441/KU-0060648作用浓度的增加而逐渐下降，且In（△Fmax）与抑制剂浓度呈良好的线性关系（R2=0.987/0.961）；从1540种小分子化合物中筛选出多种显著降低△Fmax的候选小分子抑制剂，综合评估其潜在研究价值及细胞毒性后，我们选择了乌本苷以及五氟利多作为候选NHEJ抑制剂进行后续研究。 （3）候选 NHEJ 抑制剂通过抑制 DSB 修复来提高肿瘤细胞的放射敏感性。HRM分析及CCK8检测结果显示乌本苷和五氟利多在无细胞毒性的作用浓度范围内均可显著抑制 NHEJ 修复活性；细胞克隆存活实验表明，与单纯照射组相比，乌本苷/五氟利多联合X线照射能够明显降低Hela细胞及T98G细胞的克隆形成能力；细胞免疫荧光实验发现，相较于DMSO+照射组，候选NHEJ抑制剂+照射组的γ-H2AX和53BP1 foci消失时间明显延迟；中性彗星电泳结果显示，乌本苷/五氟利多+照射组彗星尾部 DNA 含量显著高于 DMSO+照射组；流式细胞检测结果显示：两种候选NHEJ抑制剂显著延迟X射线照射所致的肿瘤细胞G2/M期阻滞。 （4）候选NHEJ抑制剂通过间接性抑制DNA-PKcs的磷酸化来调控NHEJ修复。采用eGFP-NHEJ/HR荧光报告系统分析细胞NHEJ和HR修复活性发现，乌本苷可以同时抑制I-SceⅠ核酸酶诱导的HR 及NHEJ 修复，五氟利多仅对NHEJ修复具有抑制作用，对HR修复无明显影响；western blot结果显示两种抑制剂均可显著抑制X射线照射引起的DNA-PKcs蛋白的磷酸化，而对ATM、Chk2蛋白的表达及磷酸化水平无明显影响；体外DNA-PK激酶检测实验发现乌本苷和五氟利多对DNA-PK激酶活性无直接抑制作用，两种候选NHEJ抑制剂无法通过结合、修饰等直接作用方式调节DNA-PK激酶活性，表明二者通过影响其他相关蛋白的表达间接性地抑制DNA-PKcs的磷酸化。 结论：作为真核细胞修复DSB的主要途径，NHEJ修复会导致DNA断裂位点碱基的突变、插入或缺失。基于这一特性，本研究应用荧光定量PCR扩增含有突变位点的 DNA 片段，发现高分辨熔解曲线分析技术能够定量检测 CRISPR/Cas9系统诱导的NHEJ修复活性，从而构建了一种灵敏高效的NHEJ修复抑制剂筛选体系。从1540种上市小分子化合物中筛选出以乌本苷(强心苷类药物)和五氟利多（第一代抗精神病类药物）为代表的多种候选 NHEJ 修复抑制剂。进一步研究发现，乌本苷和五氟利多能够显著抑制X射线照射所致的DSB修复，从而提高肿瘤细胞的放射敏感性，两种候选NHEJ抑制剂通过间接性抑制辐射诱导的DNA-PKcs的磷酸化来调控肿瘤细胞DNA双链断裂修复。
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