摘要
杜仲（Eucommia ulmoides Oliver）是第三纪孑遗植物，单科单属单种，在中国主要分布于四川、湖南、贵州等地区。杜仲药用成分主要为苯丙素类、环烯醚萜类、木脂素类等化合物，且木脂素类化合物中的松脂醇双葡萄糖苷具有双向调节血压功效。研究表明，Dirigent （DIR）蛋白在生物氧化酶或氧化剂的存在下，可以指导木质素单体偶联形成二聚体，进而参与木质素和木脂素分子的生物合成，并在响应生物和非生物胁迫因素诱导过程中有重要作用。因此，对 DIR 蛋白的功能进行研究具有重要的价值。本研究以实验室前期克隆得到EuDIR1蛋白编码基因为基础，对EuDIR1基因进行原核表达、同时进行遗传转化方面的研究，研究结果如下： 1、EuDIR1基因原核表达及蛋白纯化 本研究构建携带His标签原核表达载体pET-30a-EuDIR1和pMCSG19-EuDIR1，将原核表达载体分别转化表达宿主菌E.coli BL21(DE3)。结果显示，15℃下0.1 mmol/L IPTG诱导6h后，蛋白的沉积量达到最高值，但其表达模式主要为包涵体。对包涵体进行纯化，收集目的蛋白，对其进行复性后，经Western Blot对His标签鉴定和蛋白质谱鉴定，获得可溶性且纯度较高的EuDIR1蛋白。 2、EuDIR1蛋白体外功能分析 为了研究EuDIR1蛋白的潜在“dirigent”活性，本研究在对照组中使用氧化剂过硫酸铵和O2催化底物E-松柏醇，进行氧化偶联反应，生成手性化合物。经手性柱HPLC（Chiralpak IB）分析，生成(+)-松脂醇和(-)-松脂醇的外消旋混合物，其中(+)-松脂醇含量为8.02μg/L。在实验组中，经氧化剂过硫酸铵和O2催化底物E-松柏醇后，加入EuDIR1蛋白，生成的产物与对照组相同，其中(+)-松脂醇含量为9.16 μg/L。研究表明，在EuDIR1蛋白存在的情况下， E-松柏醇的氧化偶联优先形成(+)-松脂醇。同时，本研究证实 EuDIR1 蛋白对尖孢镰刀菌和污黑腐皮壳菌均有一定的抑制作用，且EuDIR1蛋白对尖孢镰刀菌和污黑腐皮壳菌的最小抑菌浓度分别为912.5和1825μg/mL。 3、杜仲中EuDIR1基因表达量分析 本研究构建植物过表达载体 pSH737-35S-EuDIR1，通过热击法转化农杆菌 LBA4404，利用农杆菌介导的杜仲下胚轴转化法，经GUS组织化学染色和PCR验证，获得5株EuDIR1基因过表达杜仲组培苗。为研究EuDIR1基因在杜仲的表达水平，分别对EuDIR1基因过表达杜仲、转空载体杜仲和野生型杜仲的茎、叶和根中的EuDIR1基因的表达量进行测定。结果显示，EuDIR1基因过表达杜仲的茎、叶和根中的EuDIR1基因表达水平高于野生型杜仲。
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