摘要
骨质疏松症在全球各个国家变得越来越普遍，也越来越受到重视。它是较多见的老年疾病之一，主要表现为骨微观结构发生损害、骨量减少。随着人口老龄化，它已经逐渐成为一个严重的医学问题甚至社会问题。几乎所有情况下，OP 患者均存在成骨功能与骨吸收作用的不平衡，可以表现为破骨细胞功能增强，而成骨形成相对减弱。 药物治疗临床工作中治疗OP的重点也是难点，由于目前较常使用的抗骨质疏松药物（如双磷酸盐类）虽然治疗效果明显，但仍有很多不良反应与并发症，所以天然中药，特别是中药单体逐渐成为治疗骨质疏松的新研究热点。中药单体具有纯天然、副作用小、生物活性高等特点，如果其抗骨质疏松作用明显，副作用更小的话，将为治疗OP提供新的方法。 人参皂苷 Rb2 是人参中发现最大量皂苷有效成分。通过本课题组前期研究，发现 Rb2 可以增加绝经后骨松小鼠骨量，减少骨丢失，通过大剂量地塞米松诱导的小鼠骨髓间充质干细胞凋亡，Rb2对其有保护作用，能抑制细胞凋亡；并且可以拮抗过氧化氢诱导的氧化作用来促进MC3T3-E1成骨前体细胞的增殖，增强成骨特异基因表达。目前对于 Rb2 作用于破骨细胞的作用和机制仍不清楚，本实验将通过体外培育和诱导破骨细胞，验证Rb2对破骨细胞有无抑制作用，并且探究Rb2调控破骨细胞的机制。 目的： 研究不同浓度 Rb2 对体外破骨细胞分化的作用及破骨特异性基因表达情况，探究其是否能通过自噬途径对破骨细胞起到抑制作用，并试图阐明其影响破骨细胞的分子生物学机制。 方法 ① 培养RAW264.7细胞，在适当浓度传代，并用100ng/ml浓度RANKL诱导破骨分化。 ② 处死骨质疏松模型小鼠，取原代细胞，加入M-CSF和RANKL诱导破骨分化。 ③ 实验共分为4个组：细胞系分为对照组（只加RANKL，不含Rb2），不同浓度实验组（加RANKL及0.1μ M，1μ M，10μ M的Rb2）。原代破骨细胞分组与实验动物分组相同(假手术组，单纯去势组，低剂量Rb2组及高剂量Rb2组)。 ④ CCK-8检测Rb2毒性：将P3代RAW264.7破骨前体细胞按5000个/孔接种于96孔板，分别加入不同浓度（0μ M，0.1μ M，1μ M，10μ M）Rb2，在24h、48h及72h时换为含10%CCK-8溶液的培养基，培养2小时，检测Rb2对细胞的毒性。 ⑤ TRAP染色：按8000个/孔的浓度将细胞接种于48孔板，按分组加入不同培养液，第3天换液，诱导4-5天，用抗酒石酸磷酸酶染色（Tartate-resistant factor acid phosphatas，TRAP），以3核以上作为阳性细胞计数。同法检测原代破骨细胞。 ⑥ 破骨特异基因检测：按6×104/孔接种于6孔板，破骨诱导4-5天后，采用RT-PCR方法检测破骨特异性基因TRAP、NFATc1的mRNA表达。同法检测原代破骨细胞。 ⑦ 自噬相关蛋白检测：按上述方法将RAW264.7 细胞接种于6孔板并诱导破骨细胞，采用Western-blot检测LC3及Beclin-1表达情况。 ⑧ 相关通路蛋白检测：按上述方法将RAW264.7 细胞接种于6孔板并诱导破骨细胞，检测mTOR通路蛋白表达情况。 结果： ① 在本实验中， Rb2对RAW264.7细胞无明显毒性作用，各组细胞无明显变性或死亡。 ② TRAP染色随着Rb2浓度增加，破骨细胞体积明显减小，细胞数量明显减少， 48孔板破骨细胞计数，对照组(168.2±22.6)， 0.1μ M组（131.0±16.3）， P=0.018；1μ M 组（98.8±17.9），P﹤0.01；10μ M 组（85.8±17.3），P﹤0.01。实验动物原代破骨细胞染色得出相同抑制趋势结果。 ③ 与对照组相比，各Rb2组破骨分化特异性基因TRAP、NFATc1的mRNA表达均明显下降，P﹤0.05。 ④ 随Rb2浓度增加，LC3II与LC3I的比值逐渐升高，Beclin-1表达量也有上升趋势。 ⑤ Rb2能显著降低mTOR蛋白的表达，抑制作用与浓度成正比。 结论： Rb2 在体外可以明显抑制破骨细胞生成，同时降低破骨分化特异性基因的表达量。而与对照组相比，自噬相关蛋白显著增加，说明抑制破骨细胞分化的作用可能是通过自噬途径来实现的，并且mTOR通路Rb2调控破骨细胞的过程中能够发挥重要的作用。
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