摘要
慢性高原病（chronic mountain sickness, CMS）以严重的低氧血症和红细胞过度积累为主要临床表现，除骨髓造血增加外，造血细胞凋亡下调亦参与了过度的红细胞生成。在红细胞生成过程中，红细胞生成素、血管内皮生长因子等细胞因子介导的PI3K-Akt途径发挥着重要的作用，激活的PI3K-Akt信号通路通过调节细胞凋亡相关分子Bcl-xl、caspase-9等，引起细胞凋亡下调。在肿瘤性疾病中， Akt抑制剂通过下调抗凋亡分子Bcl-2 或Bcl-xl和上调促凋亡分子caspase-9 而促进肿瘤细胞的凋亡。CMS作为一种良性的骨髓红系细胞慢性增殖性疾病， PI3K-Akt信号通路可能参与其发病。 本论文包括三部分内容：第一部分研究PI3K-Akt信号途径对低氧培养的K562细胞凋亡和增殖的影响：以K562细胞为研究对象，在1%浓度的低氧环境下培养K562细胞，通过过表达和沉默Akt1，分别观察过表达和沉默Akt1后K562细胞凋亡相关分子Bcl-xl、caspase-9的变化及其对K562细胞凋亡和增殖的影响。结果显示：与慢病毒对照组比较，K562细胞中过表达Akt1后，Bcl-xl蛋白增加（0.61 ±0.08 vs 0.94 ±0.02, P=0.0134），caspas-9蛋白减少（0.99 ±0.059 vs 0.50 ±0.09, P=0.0127）；细胞增殖增加（0.83 ±0.053 vs 1.10 ±0.071，P=0.0367），但凋亡率未显示出统计学变化（28.21 ±8.45 vs 11.73 ±0.72，P=0.1238）。K562细胞中沉默Akt1后，与空转对照组比较， Bcl-xl蛋白减少（1.0 ±0.089 vs 0.54 ±0.07，P=0.0156），caspas-9蛋白增加（0.39 ±0.11 vs 0.99 ±0.069，P=0.0097）；细胞增殖降低（0.83 ±0.04 vs 0.59 ±0.02，P=0.074）而凋亡率增加（25.42 ±4.11vs 58.90 ±10.80，P=0.0442）。提示低氧培养的K562细胞中，Akt1可部分通过改变caspase-9和Bcl-xl的表达水平而调节细胞的增殖和凋亡。第二部分进行PI3K-Akt信号途径对CMS患者骨髓有核红细胞凋亡影响的体外实验研究：以CMS患者22例为研究组，以在相似海拔高度和居住时间的健康人或单纯性陈旧性骨折取内固定的患者20例为对照组，采集骨髓并分离单个核细胞，体外培养有核红细胞，流式细胞仪检测其凋亡率，Western blotting和RT-PCR测定Akt1、Bcl-xl、caspase-9蛋白及mRNA的表达水平；以Akt抑制剂预处理体外培养的有核红细胞，观察其对有核红细胞凋亡率以及Akt1、Bcl-xl、caspase-9蛋白和mRNA表达水平的影响。进行对比分析，了解CMS患者骨髓造血细胞凋亡变化情况及Akt1抑制剂预处理的体外影响效应。结果显示：体外培养的CMS组患者骨髓有核红细胞凋亡率低于对照组（7.94 ±3.01 vs 11.79 ±4.94，P<0.05），Akt1 mRNA 和Bcl-xl 蛋白及mRNA表达高于对照组（P<0.05），caspase-9 蛋白和mRNA表达低于对照组（P<0.05）。经Akt1抑制剂Perifosine干预后两组凋亡率均增加（P < 0.001），Bcl-xl 蛋白和mRNA、p-Akt蛋白表达减少（P<0.05），caspase-9蛋白和mRNA表达增加（P<0.05 ）。CMS组血红蛋白浓度与有核红细胞凋亡呈负相关（r =-0.5748, P =0.0064），而与Bcl-xl mRNA呈正相关（r=0.6394，P=0.0018）；有核红细胞凋亡与Akt1 mRNA（r =-0.5888, P = 0.0050）和Bcl-xl mRNA（r =-0.6942, P =0.0005）呈负相关。提示：CMS患者骨髓有核红细胞凋亡下调，而且PI3K-Akt 信号途径被激活，经体外Akt1抑制剂处理后可以增加CMS患者骨髓有核红细胞的凋亡, 说明PI3K-Akt途径与CMS患者的红细胞过度积累有关。为进一步明确PI3K-Akt信号途径在CMS红细胞积累中的作用及Akt1抑制剂的干预效应，本论文第三部分进行了PI3K-Akt 信号途径对CMS骨髓有核红细胞凋亡影响的体内实验研究：以100只雄性Wistar大鼠为研究对象，分为6组：常氧对照组(20只)、CMS模型组（低氧处理，无药物干预；20只）、CMS模型对照组（低氧加生理盐水2mL/天灌胃处理；10只）、低剂量塞来昔布干预组（低氧加塞来昔布20mg/kg/天灌胃处理；20只）、高剂量塞来昔布干预组（低氧加塞来昔布40mg/kg/天灌胃处理；20只）和Perifosine干预组（低氧加Perifosine 36mg/kg/天灌胃处理；10只）。常氧组大鼠在海拔2260m的西宁常氧条件下饲养；低氧组大鼠利用低压氧仓模拟海拔5500米的高原低氧条件（氧浓度10.8%，压力54.02Kpa），每天低氧处理22小时，制备CMS动物模型；干预组给予相应的药物和剂量处理。饲养30天后，腹腔注射乌拉坦麻醉大鼠，采集腹主动脉血进行血气分析、测定红细胞、血红蛋白及红细胞压积；分离血清，用ELISA法测定EPO水平；采集骨髓液，分离单个核细胞，以CD45-CD71+标记有核红细胞，采用流式细胞术检测大鼠骨髓有核红细胞凋亡率和caspase-9、Bcl-xl、Akt1蛋白表达情况并对比分析，了解Akt抑制剂处理的体内干预效应；同时对低氧处理和常氧处理的大鼠各5只进行肺动脉压测定。结果显示：低氧处理组大鼠肺动脉压力明显高于常氧组（66.06 ± 17.36 vs 29.78 ±4.47，P<0.001），低氧处理组大鼠红细胞、红细胞压积、血红蛋白水平和肺动脉压均高于常氧组（P<0.05），而Akt抑制剂干预后CMS大鼠红细胞、红细胞压积、血红蛋白水平与未干预组无差异（ P > 0.05 ）。CMS大鼠模型CD45-CD71+标记的骨髓有核红细胞凋亡及单个核细胞凋亡无明显下调（ P >0.05），骨髓有核红细胞Akt、Bcl-xl、caspase-9蛋白亦无明显变化（p>0.05）。这部分研究结果提示：Akt1抑制剂对大鼠单个核细胞凋亡及凋亡相关分子Akt1、Bcl-xl、caspase-9无明显影响。 通过以上研究发现，低氧培养的 K562 细胞中， Akt1 可部分通过改变caspase-9、Bcl-xl的表达水平而影响细胞的增殖和凋亡。CMS患者骨髓有核红细胞凋亡下调，而且PI3K-Akt 信号途径被激活，经体外Akt抑制剂处理后可以增加CMS患者骨髓有核红细胞的凋亡，PI3K-Akt途径与CMS患者的红细胞过度累积有关。但CMS模型大鼠体内研究显示Akt抑制剂对CMS模型动物骨髓有核红细胞凋亡的干预作用不明显。需进一步深入研究CMS骨髓造血细胞凋亡变化机制并探索临床治疗新途径。
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