摘要
衰老标记蛋白-30(SMP30)存在三种可变剪接体，分别为全长（长度为900bp）、外显子4缺失的转录本（长度为684bp）、外显子4、5缺失的转录本（长度为552bp）。900bp的转录本表达的蛋白为SMP30-a，684bp的转录本表达的蛋白为SMP30-b，552bp的转录本表达的蛋白为SMP30-c。SMP30-a在肝癌组织中低表达，对肝癌细胞的增殖和侵袭迁移具有抑制作用，关于SMP30-b和SMP30-c的研究较少。 目的:本文通过构建SMP30不同转录本慢病毒表达载体，在肝癌细胞中进行过表达，进而研究SMP30不同蛋白亚型对肝癌细胞生物行为学的影响。 方法:(1)构建SMP30三个转录本的真核表达载体，通过瞬时转染293T细胞，Western blot检测验证SMP30三个转录本在真核细胞内是否都能够表达。(2)构建SMP30三个转录本的慢病毒表达载体，用携带目的基因的慢病毒和空载慢病毒分别感染肝癌细胞SK-Hep-1，通过嘌呤霉素筛选后构建出稳定转染的SMP30转录本的过表达细胞株。(3)QuantitativeReal-time PCR(qRT-PCR)和Western Blot分别检测基因过表达前后SMP30三个转录本在转录水平和翻译水平的变化。(4)Transwell侵袭迁移实验检测细胞侵袭迁移能力。(5)CCK-8实验检测肝癌细胞的增殖能力。(6)流式细胞术检测细胞周期、凋亡的变化。(7)Western Blot检测SMP30三个转录本过表达前后周期相关蛋白的表达情况。 结果:(1)SMP30三个转录本在293T细胞内过表达后，Western blot检测发现三个转录本在蛋白水平均能够表达。(2)通过嘌呤霉素筛选后成功构建出SK-Hep-1-LV5、SK-Hep-1-SMP30-a、SK-Hep-1-SMP30-b，SK-Hep-1-SMP30-c稳转细胞株。SK-Hep-1-SMP30-a、SK-Hep-1-SMP30-b，SK-Hep-1-SMP30-c细胞中SMP30基因在mRNA水平和蛋白水平的表达均明显上调(P＜0.01)。(3)CCK8细胞增殖实验结果显示:SK-Hep-SMP30-b和SK-Hep1-SMP30-c两组细胞的增殖能力被抑制(P＜0.05)，SK-Hep-1-SMP30-a组细胞增殖能力的变化不明显(P＞0.05)。(4)Transwell侵袭迁移实验显示SK-Hep-1-SMP30-a、SK-Hep-1-SMP30-b，SK-Hep-1-SMP30-c三组细胞的迁移和侵袭能力均降低(p＜0.05)。(5)细胞周期实验结果显示:SK-Hep1-SMP30-b和SK-Hep1-SMP30-c组细胞的S期明显升高，出现了S期阻滞(P＜0.05)，SK-Hep1-SMP30-a细胞的周期变化则不明显(P＞0.05)。(6)细胞凋亡实验结果显示:SK-Hep-1-SMP30-a、SK-Hep-1-SMP30-b，SK-Hep-1-SMP30-c三组细胞凋亡的变化均不明显(P＞0.05)。(7)周期相关蛋白表达情况:周期蛋白CyclinA2、CyclinD3在三组细胞中表达下调(P＜0.05);周期蛋白依赖性激酶抑制因子P21Waf1/CiP1在三组细胞中表达量均上调(P＜0.05);周期蛋白CyclinD1、周期蛋白依赖性激酶CDK4、CDK6、周期蛋白依赖性激酶抑制因子P18INK4KC、P27KiP1在三组细胞中表达量均无明显变化(P＞0.05)。周期蛋白依赖性激酶CDK2仅在SMP30-c过表达细胞中表达减低(P＜0.05)，在SMP30-a和SMP30-b过表达细胞中未出现明显变化(P＞0.05)。 结论: (1)SMP30三种转录本都能通过下调周期蛋白CyclinA2、CyclinD3，上调周期蛋白依赖性激酶抑制剂P21Waf1/CiP1的表达，从而抑制肝癌细胞的增殖。 (2)SMP30三个转录本都能抑制SK-Hep1细胞的侵袭和迁移。 (3)三种蛋白对SK-Hep1细胞的凋亡均无明显抑制作用。 (4)SMP30-c对SK-Hep1细胞的抑制作用最强可能与其能够下调周期蛋白依赖性激酶CDK2的表达关系密切。
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