摘要
目的: 本课题主要研究FBW7对人非小细胞肺癌CCL2的表达的影响并通过小鼠Lewis肺癌细胞LLC和基因敲除小鼠模型观察肿瘤细胞来源的CCL2对肿瘤侵袭转移的可能作用。在人非小细胞肺癌细胞A549和H1299中敲低或过表达FBW7后检测其对CCL2mRNA水平和蛋白表达的影响，探索FBW7是否通过负向调控Notch通路来调控肿瘤细胞来源的CCL2的水平而发挥肿瘤抑制作用，并利用CCL2基因敲除动物模型验证肿瘤细胞来源的CCL2在FBW7抑制NSCLC细胞侵袭转移的作用，为靶向FBW7/Notch/CCL2轴的癌症治疗策略提供理论基础和新的思路。 方法: 1.运用Real-time PCR和Western Blot蛋白免疫印迹技术检测FBW7在4株不同人非小细胞肺癌细胞系中的表达情况;Real-time PCR和酶联免疫吸附测定(ELISA)方法检测CCL2在4株不同NSCLC细胞中的表达情况。 2.应用慢病毒转染技术构建FBW7稳定低表达的NSCLC细胞A549ShFBW7和H1299ShFBW7以及其空载对照细胞株A549ShCtrl和H1299ShCtrl;采用脂质体瞬时转染方法构建FBW7高表达的NSCLC细胞A549-FBW7和H1299-FBW7以及其空载对照细胞A549-EV和H1299-EV;运用Real-time PCR和Western Blot蛋白免疫印迹技术检测其干扰以及过表达的效率。运用Real-time PCR、酶联免疫吸附测定(ELISA)方法检测干扰或过表达FBW7对CCL2表达的影响。 3.通过Western Blot蛋白免疫印迹技术检测干扰或过表达FBW7的细胞中FBW7和Notch信号通路相关蛋白如Notch1，Notch3，C-Myc，C-Myb，CylingE1，MAML-1等的表达情况。 4.利用细胞划痕实验和transwell迁移实验检测FBW7低表达的NSCLC细胞及其对照细胞在不同条件培养基培养后迁移能力的差异。 5.Notch通路抑制剂LY3039478作用于FBW7低表达的A549、H1299细胞和对照组细胞，用Real-time PCR、ELISA检测CCL2的表达;用细胞划痕实验和transwell迁移实验检测Notch抑制剂能否抑制条件培养基诱导的低表达FBW7细胞的迁移能力。 6.用慢病毒转染技术构建荧光素酶标记的稳定干扰FBW7的小鼠Lewis肺癌细胞LLC-luc-ShFBW7和其对照细胞LLC-luc-ShCtrl，运用Real-time PCR和Western Blot技术检测其干扰效率后，通过小鼠尾静脉注射到野生型和CCL2基因敲除小鼠体内，利用小动物活体成像技术动态监测小鼠肿瘤生长和转移情况。 结果: 1.Real-time PCR和Western blot结果显示FBW7在H1299细胞中表达最高，在H441细胞中表达最低;Real-time PCR和ELISA结果显示CCL2在H441细胞中表达最高，在H1299细胞中表达最低。 2.本研究应用慢病毒转染技术成功构建了FBW7稳定低表达的NSCLC细胞A549ShFBW7和H1299ShFBW7以及其空载对照细胞株A549ShCtrl和H1299ShCtrl;采用脂质体瞬时转染方法构建了FBW7高表达的NSCLC细胞A549-FBW7和H1299-FBW7以及其空载对照细胞A549-EV和H1299-EV。 3.Real-time PCR和ELISA结果显示敲低或过表达A549、H1299细胞中的FBW7，肿瘤细胞中的CCL2表达水平分别呈现上升或下降的趋势(P＜0.05）。 4.Western blot结果表明在A549、H1299细胞中的敲低FBW7，Notch信号通路相关蛋白Notch1，Notch3，C-Myc，C-Myb，CylingE1，MAML-1等的表达上升，RBPSuH表达下降;在A549、H1299细胞中过表达FBW7，Notch信号通路相关蛋白Notch1，Notch3，C-Myc，C-Myb，CylingE1等的表达下降，HES1表达上升。 5.细胞划痕实验和transwell迁移实验结果显示在不同培养基培养条件FBW7低表达的A549、H1299细胞，与其对照组细胞相比细胞迁移能力显著增强(P＜0.05）;空载对照细胞在常规培养基培养和在条件培养基培养（对照组细胞分泌的培养基上清液）相比，细胞迁移能力无差异;FBW7低表达的A549、H1299细胞在常规培养基培养和在条件培养基培养(FBW7低表达细胞分泌的培养基上清液)相比，在条件培养基培养其迁移能力增强(P＜0.05);CCL2中和抗体能逆转或抑制FBW7调控的肿瘤细胞来源的CCL2诱导的NSCLC细胞的迁移能力（P＜0.05）。 6.Real-time PCR和ELISA结果显示不同浓度Notch通路抑制剂LY3039478，对空载对照细胞中的CCL2表达水平无差异，但能抑制FBW7低表达细胞中的CCL2水平的上升(P＜0.05）;细胞划痕实验和transwell迁移实验结果显示使用Notch通路抑制剂LY3039478能抑制条件培养基诱导的低表达FBW7细胞的迁移能力(P＜0.05）。 7.动物实验结果显示:四组小鼠的肿瘤转移能力强弱依次为LLC-luc-ShFBW7WT小鼠＞LLC-luc-ShCtrl WT小鼠＞LLC-luc-ShFBW7CCL2KO小鼠＞LLC-luc-ShCtrl CCL2KO小鼠，差异具有统计学意义(P＜0.05)。敲低FBW7的肿瘤细胞在小鼠体内生长和转移能力均比对照组细胞强。敲除小鼠的CCL2基因能抑制FBW7低表达小鼠肺癌细胞在小鼠体内的生长和转移能力。下调FBW7介导的肿瘤细胞来源的CCL2增加可促进小鼠肿瘤细胞的转移，即FBW7负向调控肿瘤细胞来源的CCL2而抑制小鼠肿瘤生长和转移。 结论: FBW7是通过负向调控Notch通路来抑制非小细胞肺癌细胞CCL2的表达，抑制非小细胞肺癌的侵袭和转移，本研究为靶向FBW7/Notch/CCL2轴的癌症治疗提供理论基础和新的思路。
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