摘要
研究目的： 本实验通过运用CRISPR/Cas9技术构建S100A8基因敲除的低分化鼻咽癌细胞CNE2细胞系，研究S100A8基因对鼻咽癌细胞CNE2的增殖以及侵袭迁移的影响。 研究内容： 研究内容主要包括以下三个部分：1.通过慢病毒转染构建Cas9蛋白的鼻咽癌稳转细胞株;2.通过质粒转染将靶向S100A8基因的gRNA导入上一步骤获得的细胞株中，对S100A8基因进行敲除;3.研究S100A8基因敲除对鼻咽癌细胞侵袭迁移的影响。 研究方法： 1.通过慢病毒转染的方法，选择合适的MOI值分别对CNE1细胞、CNE2细胞进行转染，转染后选择适当浓度的杀稻瘟菌素(BSD)对细胞进行抗性筛选，收集并培养对BSD有抗性的CNE1、CNE2细胞。以没有转染慢病毒的CNE1细胞与CNE2细胞作为空白对照，通过qRT-PCR实验与Western Blot实验，检测细胞内Cas9基因与蛋白的表达情况，以验证Cas9蛋白的鼻咽癌稳转细胞株是否构建成功。 2.通过gRNA在线设计网站针对S100A8基因的第二与第三外显子设计gRNA序列;通过Esp3I Fast Digest对LentiGuide-Puro质粒载体进行双位点酶切，通过琼脂糖凝胶电泳与胶回收实验获得酶切产物，将gRNA连接到LentiGuide-Puro载体上，构建靶向S100A8基因的载体并通过脂质体转染将重组质粒转染进前期构建的可稳定表达Cas9蛋白的鼻咽癌细胞中，使Cas9蛋白在gRNA的引导下对S100A8基因进行敲除。通过Western Blot对敲除结果进行验证。 3.通过细胞划痕实验与Transwell迁移实验检测S100A8基因敲除后，CNE2细胞的迁移能力是否受到影响、受到怎样的影响;通过Transwell侵袭实验检测CNE2细胞在S100A8基因被敲除后，侵袭能力是否受到影响及受到怎样的影响。通过qRT-PCR检测S100A8基因敲除后CNE2细胞内侵袭迁移相关的基质金属蛋白酶(MMPs)的mRNA表达是否受到影响。 研究结果： 1.qRT-PCR实验结果表明，经过慢病毒转染的CNE1细胞与CNE2细胞均有Cas9蛋白的基因表达，而未经转染的CNE1细胞与CNE2细胞不表达Cas9蛋白的基因;Western Blot实验结果显示，未经慢病毒转染的CNE1细胞与CNE2细胞不能表达Cas9蛋白，而经过转染的CNE1细胞与CNE2细胞均可Cas9蛋白。 2.从琼脂糖凝胶电泳结果可以看出，经过Esp3I双位点酶切获得正确的LentiGuide-Puro线性化片段;菌液PCR与测序结果表明已成功将gRNA连接到LentiGuide-Puro质粒载体上;通过Western Blot结果可以看出，未经任何处理的CNE2细胞、前期实验获取的Cas9蛋白稳转的CNE2细胞株、转染了LentiGuide-Puro空白质粒的Cas9蛋白稳转的CNE2细胞均有S100A8基因的表达，而转染了LentiGuide-Puro-gRNA重组质粒的Cas9蛋白稳转的CNE2细胞不再表达S100A8基因。 3.从细胞划痕实验结果可以看出，S100A8基因敲除后CNE2细胞的迁移面积明显降低，未经处理的CNE2细胞迁移率最高可达到基因敲除后细胞迁移率的两倍(P＜0.05);从Transwell迁移实验结果可以看出，S100A8基因敲除后CNE2细胞的穿膜能力明显受到抑制(P＜0.05);Transwell侵袭实验的结果表明，S100A8基因敲除后CNE2细胞的侵袭能力受到抑制(P＜0.05)。从基因层面来看，S100A8基因敲除后，侵袭迁移相关的机制金属蛋白酶MMP3、MMP7、MMP12的mRNA表达量下调(P＜0.05)。 研究结论： 与正常的鼻咽癌低分化细胞CNE2相比，S100A8基因敲除后的鼻咽癌细胞的侵袭迁移能力显著降低。
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