摘要
本文从以下两部分进行了阐述： 第一部分 巨噬细胞培养并对M1和M2细胞表型的体外诱导与鉴定 目的:巨噬细胞来源于血液中分化的单核细胞，起到非特异性免疫作用，属于机体免疫系统的重要组成部分，具有识别及呈递抗原、调节免疫进程、清除异物、免疫监视及吞噬等影响机体细胞的生长发育的生物学功能。在机体的特定微环境中，巨噬细胞按照功能及形态可衍生为两种不同的细胞表型，即M1和M2表型，前者属于巨噬细胞的经典激活途径，具有抗原杀伤与抑制肿瘤进展的功效;后者属于巨噬细胞的替代激活途径，其可参与炎症反应、促进血管生成和组织的再造等，在临床上可认为M2型细胞功能属于促进癌细胞的发生发展。本部分研究旨在体外构建巨噬细胞M1和M2这两种极化细胞的模型，为后续对极化巨噬细胞的进一步研究奠定基础。 方法:利用佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)刺激U937细胞，然后加入IL-4和IL-13诱导出M2表型，后用脂多糖和IFN-γ诱导出M1表型;使用qPCR分析通过TGF-β，Arg-1和TNF-α表达水平鉴定巨噬细胞的表型;使用蛋白质印迹分析来定量Arg-1和iNOS蛋白质表达;此外，采用酶联免疫吸附测定方法(ELISA)用于检测IFN-γ，TGF-β和IL-10的分泌水平。 结果:与未分化的巨噬细胞相比M1型巨噬细胞的生长形态表现为不规则性或长梭形状，高表达TNF-α、iNOS和IL-12; M2型巨噬细胞的生长形态表现为多呈圆形或类圆形，抱团样生长，且高表达Arg-1，TGF-β和IL-10。 结论:本实验的研究结果与前人的研究相似，M1与M2表型的巨噬细胞在蛋白质与mRNA的表达水平存在差异性表达，并在实验中成功培育出不同激活状态的巨噬细胞，以用于后续的实验操作。 第二部分 巨噬细胞极化过程的结合蛋白质组学、转录组和甲基化间的差异 目的:蛋白质组学、转录组学、基因组学的发展标志着我们正在进入后基因时代，这对于医学领域上基于细胞内更精细的研究起促进作用，这对今后的精准医疗的发展和进一步研究疾病的发生发展具有重要意义。 方法:对三种组学进行微阵列（lncRNA与mRNA）、蛋白质组学分析(TMT)、DNA甲基化免疫沉淀测序(MeDIP-Seq)、qPCR和MeDIP-qPCR定量、酶联免疫吸附试验(ELISA)、蛋白质印迹(Western blotting)等方法进行检测并结合统计学分析结果。 结果:总共鉴定了5，572种蛋白质，20，757个转录物和80，550个DNA甲基化峰值，其中结果显示包括1，039种蛋白质，2，286个mRNA和260个甲基化区域在U937衍生的巨噬细胞从M2极化为M1表型的过程中具有差异化表达。 结论:部分蛋白质组学、转录组学、基因组学的成分可影响巨噬细胞极化过程，即成为具有经典活化的巨噬细胞(M1)或替代性活化的巨噬细胞(M2)的过程，从而对相应地调节机体免疫系统、肿瘤微环境和肿瘤转移的相关进程。 第三部分 蛋白质组、转录组和DNA甲基化组间的相关性研究 目的:随着对细胞的研究的深入，在关于RNA，蛋白质与DNA甲基化之间的研究在不断的深入，且不少研究可直接或间接地显示其能相互影响彼此的进展，从而影响细胞的代谢与生长。为此，探索出它们之间的明确关系对今后调节细胞生命活动上具有重要的意义，特别是对于疾病的研究层面更具临床意义。 方法:通过对三种组学生物信息学的GO、Reactome等数据库、微芯片检测、基因聚类分析、蛋白质表达谱、并对第二部分得到的有差异的数据等进行集成分析，并结合临床HCC样本对其中的具有明显差异表达的lncRNAs RP11-191G24.1进行验证。 结果:结合GO富集分析显示差异蛋白和基因主要在免疫应答调节，细胞外结构组织和受体领域中富集;在蛋白质组数据中始终下调的18种受体中的5种（ITGAM，ITGAL，ITGAE，NRP2和CD44）在转录组数据中也一致地出现表达下调;CD163和CD69的mRNA表达与观察到的相应蛋白表达相关;差异表达的转录物中165种在蛋白质组和转录组水平上都具有差异表达，转录后调控的检测显示M1/M2细胞中转录组和蛋白质组之间的整体关系具有很大程度的多样性;且发现17个lncRNA与DNA甲基化改变具有显著相关性;与极化相对应的，在启动子区域中DNA甲基化的获得或丧失是非常显著的，提示顺式作用和反式作用模式可能是关键调节因素;用于表观遗传调节和癌症信号传导途径的几个代表性区域被鉴定为与M1/M2极化相关。为了进一步检测这3，703个具有差异表达的lncRNA能否作为生物标志物的潜力，通过临床检测HCC组织样品及其相应的相邻癌旁组织，结果表明RP11-191G24.1表达(p=0.036)与淋巴结转移(p=0.06)和微血管侵犯相关(p=0.00)。 结论:转录后调控的检测显示M1/M2细胞中转录组和蛋白质组之间的整体关系具有很大程度的多样性;RP11-191G24.1具有作为HBV相关的HCC预后生物标志物的潜力;DNA甲基化是调节lncRNA表达的关键调节机制，总之，蛋白质组、转录组和DNA甲基化组之间存在相互联系并发生相互作用从而影响巨噬细胞的极化过程。
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