摘要
目的:为了将化疗药物和免疫治疗剂分别精准递送至不同的靶细胞内发挥各自疗效，同时避免化疗药对巨噬细胞的杀伤，本文构建了双向“归巢”pH/酶响应的双载药纳米药物递送系统，然后对其响应特性、体内外M2型肿瘤相关巨噬细胞(TAM)表型重塑、抗肿瘤活性及抗转移能力等进行了系统研究。 方法:(1)纳米系统的构建与表征首先利用重链去铁蛋白(HFn)酸响应自组装的特性，将化疗药阿霉素(DOX)装载于蛋白笼内，形成DOX@HFn纳米粒;然后通过薄膜分散法合成荷载白藜芦醇(Res)的半乳糖苷功能化的两性离子脂质体Res@PGZL;最后将DOX@HFn纳米粒通过酰胺键连接在Res@PGZL表面得到DOX@HFn-PGZL@Res纳米控释系统。通过紫外光谱和核磁共振氢谱等对纳米系统进行结构表征;采用激光纳米粒度仪和透射电镜(TEM)等考察系统的粒径电位及形态特征。 (2)体外双响应特性研究通过高效液相色谱仪和透射电镜考察该递药系统对MMP的酶响应性，确定其在MMP的存在下分离为DOX@HFn和Res@GZL两荷药载体的能力;不同pH条件下，考察DOX和Res的体外酸响应控释特性。 (3)体外TAM表型重塑、抗肿瘤活性及抗转移研究采用荧光显微镜及流式细胞仪进行细胞摄取实验，分别考察DOX@HFn对4T1乳腺癌细胞，Res@GZL对肿瘤相关巨噬细胞M2型的特异靶向性;采用ELISA试剂盒和Western blot分析Res@GZL对M2表型重塑的情况;此外，通过MTT法考察空白载体的生物相容性及该递送系统对乳腺癌细胞的抑制效果;该系统的体外抗转移能力通过划痕和Transwell等实验方法进行研究。 (4)体内靶向性及抗肿瘤活性研究以IR783荧光标记该系统，通过小鼠活体荧光成像仪研究游离IR783及IR783@HFn-PGZL在小鼠体内的组织分布情况;以荷4T1乳腺癌的BALB/c雌性小鼠为动物模型，通过肿瘤体积变化、HE染色病理切片及Tunel染色等结果分析该递送系统的抗肿瘤效果及毒副作用。 (5)体内抗转移研究同样地，以BALB/c雌性小鼠分别构建荷4T1乳腺癌的转移预防模型和已形成转移的模型，通过肺组织的转移结节及肺病理切片考察该纳米系统的体内抗转移效果。 结果:通过激光纳米粒度仪和透射电镜分析，表明该DOX@HFn-PGZL@Res纳米系统呈球形，粒径约130nm，电位约-15mV。HPLC及透射电镜结果显示:该双载药纳米系统可响应MMP2而分离为DOX@HFn和Res@GZL纳米粒。体外释药结果表明，与正常生理条件相比，DOX在肿瘤细胞内（Res在M2肿瘤相关巨噬细胞溶酶体内）酸性条件下的释药率明显增高。此外，体外细胞实验表明DOX@HFn和Res@GZL分别通过癌细胞表面的转铁蛋白受体1和M2肿瘤相关巨噬细胞表面的半乳糖受体而对其各自的靶细胞具有良好的靶向性，可避免化疗药对巨噬细胞的损伤;空白载体安全无毒，DOX@HFn-PGZL@Res组对癌细胞的增殖具有显著的抑制作用。体内活体成像结果显示，该系统在肿瘤组织的积累明显高于其他组织，具有较强的肿瘤靶向性。体内药效学和抗转移结果表明DOX@HFn-PGZL@Res联合化疗和免疫治疗，显著抑制了肿瘤生长及转移而对正常组织几乎无毒性。另一方面，体内外M2肿瘤相关巨噬细胞表型重塑的实验结果也显示Res@GZL可成功复极化M2型为M1-型，改善免疫抑制性微环境，发挥积极的免疫应答。 结论:本课题制备的DOX@HFn-PGZL@Res纳米药物递送系统可同时荷载化疗药和免疫治疗剂，并在肿瘤组织响应MMP2原位分离，双向识别癌细胞和M2型巨噬细胞，改善免疫抑制，联合化疗和免疫治疗高效地抑制肿瘤的生长及转移。
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