摘要
目的: 恶性肿瘤是威胁人类生命健康的首要疾病。据统计，2015年我国癌症新增429.16万例，死亡281.42万例，分别占据世界癌症新增病例和癌症死亡病例的22％和27％，这不仅严重损害了我国居民健康，同时也给癌症患者及其家庭带来了巨大的经济负担。此外，大多数肿瘤起病隐匿，早期症状不明显，诊断时已是中晚期，失去了手术切除的机会。目前，化疗仍是肿瘤治疗的主要手段之一。然而，传统化疗药物毒副作用强、靶向性差、容易产生抗药性，因此，靶向杀死肿瘤细胞并尽量减轻毒副作用是临床肿瘤医生和研究者一直追求的目标。探索能够定向、定位地输送到特定肿瘤病灶的高效化疗药物，降低毒副作用，也是肿瘤治疗领域的重大挑战。本研究目的在于构建一种pH响应的以聚(β-氨基酯)(PBAE)为内核，聚(乙二醇)单甲醚(MPEG)为外壳的纳米载体系统，用以负载化疗药物紫杉醇(PTX)，以期实现化疗药物的靶向递送，减轻毒副作用。 内容: 本论文的研究内容主要分为以下两部分。第一部分为MPEG-PBAE纳米粒子的制备和表征，主要包括PBAE的合成和化学结构的表征，MPEG-PBAE与MPEG-PBAE/PTX纳米粒子的制备以及表征。第二部分主要是载药MPEG-PBAE/PTX纳米粒子的抗肿瘤作用研究，包括pH响应性、体外释药特征及其细胞水平的杀伤活性研究。 方法: 1.PEG-PBAE纳米粒子的制备和表征:以5-胺基-1-戊醇和1，4-丁二醇二丙烯酸酯为原料，通过一步化学反应制备PBAE，并利用核磁共振氢谱(1H NMR)、凝胶渗透色谱(GPC)对其化学结构进行表征;然后，通过与mPEG-NH2反应合成MPEG-PBAE，利用1H NMR进行结构确证;通过沉淀法制备MPEG-PBAE及MPEG-PBAE/PTX纳米粒子。通过动态激光散射法(DLS)检测纳米粒子的粒径及其分散性;利用透射电子显微镜(TEM)观察纳米粒子的结构形态;通过高效液相色谱法(HPLC)测定MPEG-PBAE对PTX的载药量和包封率，评价其对疏水性化疗药物的负载能力;制备负载紫杉醇的纳米粒子，并通过HPLC考察载紫杉醇纳米粒子在pH7.4，6.8和5.5缓冲液中的体外释药情况，评估MPEG-PBAE/PTX的pH响应性释药特征。 2.MPEG-PBAE/PTX纳米粒子的体外研究:利用CCK-8法检测游离PTX、MPEG-PBAE、MPEG-PBAE/PTX纳米粒子对骨肉瘤细胞株MG-63的细胞毒性，计算半数抑制浓度(IC50);通过流式细胞术分析游离PTX、MPEG-PBAE/PTX对MG-63细胞凋亡的诱导作用以及对细胞周期的影响;采用划痕实验考察MPEG-PBAE/PTX纳米粒子对MG-63骨肉瘤细胞迁移能力的抑制作用;通过克隆形成实验考察MPEG-PBAE/PTX纳米粒子对MG-63骨肉瘤细胞增殖的抑制作用。 结果: 1.成功合成了PBAE、MPEG-PBAE，并通过1H NMR和GPC对它们的化学结构进行验证;结果表明我们成功构建了纳米载药体系MPEG-PBAE/PTX，DLS检测结果表明其平均粒径为80nm，稳定性良好，TEM结果显示其呈规则的球形，具有经典的“核壳结构”;PTX通过疏水相互作用高效包载于PBAE纳米核中，PTX的包封率约为7.8％。 2.MPEG-PBAE/PTX纳米粒子能够有效地负载化疗药物PTX，载药量达到7.8％;载药纳米粒子中PTX的体外释放呈现显著的pH-响应性，随着释放介质pH值的降低，PTX的释放速率明显加快，24h时，pH值为7.4，6.8，5.5时，药物释放率分别为30％，45％，71％。 3.CCK-8细胞毒性试验结果显示，空载纳米粒子MPEG-PBAE对MG-63细胞几乎没有毒性，MPEG-PBAE/PTX与游离PTX对MG-63细胞的杀伤作用没有明显差异，游离PTX与MPEG-PBAE/PTX的IC50值分别为0.1μg/mL和0.04μg/mL;在MG-63细胞中，相比于游离PTX，MPEG-PBAE/PTX对MG-63细胞能够显著诱导MG-63细胞凋亡，并阻滞细胞于G2/M期(DNA合成后期);此外，载药MPEG-PBAE/PTX能够显著抑制MG-63细胞的迁移和增殖。 结论: 本研究成功制备了MPEG-PBAE/PTX纳米载药体系，具有经典的“核壳结构”，其负载PTX的载药量约为7.8％;24h时，在pH值为7.4，6.8，5.5条件下，分别有30％，45％，71％的PTX从MPEG-PBAE/PTX释放，呈现明显的pH响应性药物释放特征。在细胞水平上，MPEG-PBAE/PTX与游离PTX具有相似的肿瘤杀伤作用;通过MPEG-PBAE纳米粒子的递送，PTX可实现逐级响应于肿瘤微环境及内涵体的弱酸性和酸性条件，并且显著抑制了MG-63细胞的增殖和迁移能力。综上所述，MPEG-PBAE/PTX纳米粒子有望作为一种化疗药物载体用于抗肿瘤化疗药物的靶向递送，具有减轻临床肿瘤患者的化疗副反应的潜力。
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