摘要
精原干细胞（SSCs）是唯一能将遗传物质传递给后代的雄性生殖干细胞，目前已被应用于雄性生殖系统疾病治疗和基因编辑动物生产等领域。但是，由于SSCs数量稀少，仅占睾丸细胞的0.02%～0.03%，严重制约了其应用。因此，需要在体外进行SSCs培养促进其增殖，以获取足够数量的细胞进行相关研究。目前，关于SSCs体外培养的研究多集中在啮齿类动物及灵长类动物上。早在2005年，小鼠SSCs便可在体外长期培养并被定向诱导分化为精子，且移植到生殖缺陷小鼠睾丸内后可繁衍出后代。相较于啮齿类动物，山羊等大型家畜SSCs体外培养技术起步晚，技术尚不成熟，需要进一步研究完善。枸杞多糖(Lyciujm BarbarumPolysaccharides,LBP)是从枸杞中提取出来的一种生物活性物质，具有抗氧化应激、抗肿瘤、调节免疫功能、提高生殖功能等作用，常应用于动物细胞体外培养中。然而，目前LBP的对山羊SSCs的体外培养及冷冻保存的作用效果尚不明确。为了研究LBP对山羊SSCs体外增殖及冷冻保存效果的影响，本研究首先将LBP进行液相色谱分析以研究其复杂的成分组成，然后采用30～45日龄的山羊睾丸（n=6）结合机械分离法、两步酶解法及差速贴壁获取纯度较高的SSCs，使用碱性磷酸酶（AKP）染色法及免疫荧光染色法对山羊SSCs进行鉴定；随后，通过添加不同浓度的LBP体外培养山羊SSCs，利用CCK-8法检测细胞增殖情况，筛选最佳体外添加浓度；然后，分别测试细胞MDA、SOD及T-AOC的含量，使用western blotting检测各试验组中的BCL-2、BAX蛋白的相对表达量，再运用real time PCR技术检测各试验组中Bcl-2和Bax、Bad基因的相对表达量；最后，添加不同浓度的LBP将SSCs进行冷冻保存，解冻后使用台盼蓝染色法测试不同试验组细胞活率，以及不同试验组的MDA、SOD及T-AOC含量，最后使用real time PCR技术检测试验组中Bcl-2和Bax基因的相对表达量。本研究主要获得以下结果： 1.将分离纯化后的SSCs使用偶氮偶联法碱性磷酸酶染色法及免疫荧光染色法进行染色，细胞呈AKP阳性，且细胞大量表达SSCs特异性标记分子CD9和GFRA1，证明经过差速贴壁及传代后可获取较高纯度的SSCs。 2.经液相色谱仪分析后可知，LBP主要由甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、岩藻糖等单糖组成。与对照组相比，培养液中添加20μg/mL或40μg/mL的LBP均可以显著促进山羊SSCs增殖，培养6d后其克隆数及细胞增殖数均显著得到提高（P<0.05），其中40μg/mL LBP添加组的效果最佳，其克隆数为57±6.73个/cm3。培养3d后，40μg/mL LBP添加组MDA含量显著低于其他组（P<0.05），而SOD及T-AOC含量高于其他组。培养9d后，20μg/mL和40μg/mL LBP添加组MDA含量显著低于其他组（P<0.05），分别为1.84±0.08、1.68±0.13μmol/mL，但是SOD及T-AOC含量显著高于其他组（P<0.05）。 3.对纯化后山羊SSCs冷冻保存，与其他试验组相比，解冻后4mg/mL LBP添加组的细胞活率显著增高（P<0.05），达到了46.35%。与对照组相比，5个试验组的MDA含量均有所降低，其中4mg/mL LBP添加组MDA含量显著低于其他试验组（P<0.05）；与对照组相比，1、2、4、8mg/mL LBP添加组的SOD及T-AOC含量均有所增加，其中4mg/mL LBP添加组的SOD及T-AOC含量显著高于其他处理组（P<0.05）。 4.Western blotting结果显示，山羊SSCs体外培养6d后，与对照组对比，5个试验组的BCL-2蛋白的表达量均获得不同程度的升高，而BAX蛋白的表达量均出现不同程度的下降，其中40μg/mL LBP添加组的变化最大，其相对表达量为0.34，160μg/mL LBP添加组的处理组变化最小，其相对表达量为0.54。 5.real time PCR结果表明，山羊SSCs体外培养6d后，与对照组相比，5个试验组的抗凋亡基因Bcl-2表达量均有所上调。其中，40μg/mL LBP试验组的相对表达量为2.44，显著高于其他组（P<0.05）。与对照组相比，5个试验组的凋亡相关基因Bax和Bad表达量均有所降低，其中40μg/mL LBP添加组的相对表达量分别为0.28、0.36，显著低于其他试验组（P<0.05）。解冻后，与对照组相比，5个试验组的抗凋亡基因Bcl-2表达量均上调，其中4mg/mL LBP组表达量显著高于其他处理组（P<0.05）；与对照组相比，5个试验组的凋亡相关基因Bax表达量均有所降低，其中4mg/mL LBP添加组的相对表达量为0.46，显著低于其他处理组（P<0.05）。 综上所述，细胞培养基础液中添加40μg/mL的LBP可获取最大的细胞克隆数及增殖数目，最有利于抑制山羊SSCs的凋亡；细胞冷冻基础液中添加4mg/mL LBP解冻后可获取较高的细胞活率，有利于SSCs的冷冻保存。
NETL