摘要
我国是世界上最大的苹果生产国和消费国，但干旱和低温制约着黄土高原产区苹果产业的健康发展。利用苹果自身的基因资源，提高苹果的抗旱、耐寒能力具有重要意义。本研究从苹果品种‘金冠’中克隆到一个锌指蛋白基因，将其命名为MdZFP2。通过序列分析、亚细胞定位和qRT-PCR等方法，对MdZFP2的序列特征、细胞定位和表达特性等进行了探究，通过酵母双杂交技术筛选出2个与MdZFP2互作的蛋白，并利用酵母双杂交和双分子荧光互补技术验证了该互作。此外，通过获得MdZFP2的干扰（RNAi）及过表达苹果转基因植物，对MdZFP2在响应苹果干旱和低温胁迫时的功能进行了初步探究。研究结果如下： 1.本研究克隆到一个MdZFP2基因，位于5号染色体，开放编码阅读框为912bp，编码303个氨基酸，蛋白分子量大小为33.93kD。序列分析表明MdZFP2具有保守的锌指蛋白DNA结合结构域DOF。亚细胞定位结果表明MdZFP2定位于细胞核，属于典型的转录因子。MdZFP2基因启动子上含有两个响应MeJA的顺式作用元件和一个响应ABA信号途径的ABRE。 2.组织特异性表达结果表明，MdZFP2在苹果的根、茎、叶中均有不同程度的表达，根系中MdZFP2表达量远高于茎和叶。MdZFP2响应干旱和低温胁迫，PEG处理6小时MdZFP2基因的表达量为处理前的6倍，自然干旱处理‘金冠’中的MdZFP2基因表达量随着处理时间延长而上升；而低温抑制MdZFP2的表达，4℃处理第12小时MdZFP2表达量降至最低，仅为处理0小时的0.17倍。除此之外MdZFP2也响应茉莉酸JA、水杨酸SA激素处理，表达量随两种处理时间延长而下降。 3.构建了MdZFP2-pGBKT7载体，发现MdZFP2蛋白具有自激活活性，经过对其蛋白截断后获得无自激活的片段MdZFP2-510aa-BD。用MdZFP2-510aa-BD片段作为诱饵筛选MdZFP2的互作蛋白，获得了两个候选蛋白MdMIEL1和MdSNF1β2，前者编码一个RING型E3连接酶，后者则是构成SnRK1磷酸化复合体的亚基之一。酵母双杂交和双分子荧光互补技术证实了该蛋白互作。另外，通过染色质免疫共沉淀实验对MdZFP2下游靶基因进行了预测。 4.构建MdZFP2干扰和过表达载体并转入苹果组培苗GL-3，获得了MdZFP2的RNAi和过表达植物。对RNAi转基因苹果植物进行长期干旱处理，发现长期干旱后MdZFP2RNAi植物株高、茎粗、光合作用参数、地上部与地下部的导水率和生物量等显著低于GL-3，表明MdZFP2RNAi植物对长期干旱处理更为敏感。随后用叶片自然失水实验进行验证，发现RNAi植物的叶片失水率显著高于GL-3，而过表达植株表现出相反的趋势。由此得出结论，MdZFP2参与苹果对干旱胁迫的响应，正调控苹果的抗旱性。另外，通过离子渗透率实验探究低温下RNAi转基因苹果植物叶片的耐寒性，发现在-4℃及-6℃时，RNAi植物叶片的相对离子渗透率均显著低于GL-3，表明MdZFP2RNAi植物的耐寒性更强。
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