摘要
多不饱和脂肪酸在人类等哺乳动物体内无法合成，必须从食物中摄取，具有不可或缺的营养价值。三酰甘油是植物种子油脂的最主要成分，也是脂肪酸最主要的储存形式。植物种子中脂肪酸的去饱和化主要发生在内质网上，反应底物为卵磷脂（PC）sn-2上的酰基脂肪酸。油酸酰基（18:1）在脂肪酸去饱和酶2（FAD2）的催化下形成亚油酸（18:2）。18:2又可以作为脂肪酸去饱和酶3（FAD3）的底物，进一步形成亚麻酸（18:3）。为了提高油料作物种子中多不饱和脂肪酸的含量，本研究将TmFAD2和AtFAD2分别在亚麻和亚麻荠中过表达，在发现FAD2共抑制的发生具有普遍性的基础上，为了突破这一瓶颈，利用拟南芥的突变体以及FAD2突变序列，开展了FAD2共抑制的机理研究，主要获得以下几个方面： 1、FAD2共抑制是油料作物多不饱和脂肪酸基因工程的瓶颈 (A)正义TmFAD2和AtFAD2分别在亚麻和亚麻荠中过表达，引起了种子多不饱和脂肪酸含量的下降。进一步分析前期在埃塞俄比亚芥菜中过表达BcFAD2的全部T3代株系，确定了FAD2转基因引起油料作物种子中多不饱和脂肪酸含量下降可能是一种在多个物种中都保守的现象，也是多不饱和脂肪酸基因工程的瓶颈。 (B)在拟南芥进行FAD2转基因试验结果表明，AtFAD2转基因引起了80%株系不同程度的基因共抑制，FAD2表达水平降低，共抑制强烈的株系脂肪酸表型与fad2突变体类似。共抑制株系中由AtFAD2编码区衍生21-22nt siRNA水平提高200-300倍，从而阻碍了种子中多不饱和脂肪酸含量的提高。发生共抑制的转基因株系在T1-T4代中还存在传代不稳定的表型。 (C)在拟南芥rdr6突变体中，FAD2共抑制得到解除，且能够过表达，从而提高了种子多不饱和脂肪酸含量。在种子多不饱和脂肪酸含量最高的两个株系中，含量分别达到了63.9%和64.0%，相较于背景中提高了12%左右。而且，在rdr6转基因株系中，传代遗传表型十分稳定。 2、介导FAD2共抑制的沉默途径 (A)DCL2和DCL4在FAD2共抑制过程中共同发挥作用，在dcl2dcl4双突变体中，超过85%的FAD2转基因株系都解除了共抑制，但其中任一单突都不能有效解除FAD2共抑制。在ago1-25突变体中，FAD2共抑制也可以解除。FAD2共抑制由RDR6-DCL2/DCL4-AGO1经典沉默通路介导。 (B)DCL1和MOS2在FAD2共抑制过程中也发挥关键作用。在dcl1-9和mos2-2突变体中，FAD2共抑制频率分别降低为23.5%和0%。值得注意的是，在Pha::AtFAD2/dcl1-9和Pha::AtFAD2/mos2株系中，几乎检测不到FAD2衍生的反义siRNA。本研究首次发现DCL1和MOS2在共抑制过程中的作用。 3、FAD2共抑制的引发机制探究 (A)通过靶序列预测发现，miR2938最有可能与AtFAD2匹配。然而，针对miR2938可能靶位点突变的FAD2转基因，仍会引起频率超过80%的共抑制。进一步分析FAD2反义链序列，预测到折叠形成的茎环结构。同样，针对于茎环结构突变的FAD2转基因也仍引起频率超过80%的共抑制。因此，初步认为FAD2共抑制的发生可能与microRNA无关。 (B)内源FAD2终止子的加入和5′端153bp处的截断，没有降低FAD2共抑制的频率，而3′端352bp处的截断能够降低FAD2共抑制频率至65%。因此，FAD2的3′端352bp区域可能参与引起共抑制。 4、参与FAD2共抑制abRNA的特征以及RDR6不依赖型沉默途径的发现 (A)在ein5-1和ski2-3突变体中，FAD2共抑制虽然频率变化不大，但是共抑制程度明显增强。表明无论是EIN5参与的5′-3′abRNA降解途径还是SKI2参与的3′-5′abRNA的降解途径对FAD2共抑制都有阻碍作用。由此，本研究推测引起FAD2共抑制的abRNA可能是5′端帽子存在异常的或者3′端尾巴存在异常的，或者5′端帽子和3′端尾巴处都存在异常的RNA。 (B)在rdr6ein5ski2三突变体中，FAD2转基因株系中仍然存在频率超过80%的共抑制现象，但程度较野生型转基因株系中弱。首次在植物中鉴定存在一种不依赖于RDR6的转录后沉默机制。 5、rdr2突变体的FAD2转基因株系中传代不稳定现象 rdr2突变体T1代转基因株系中FAD2共抑制高于野生型中共抑制频率和程度。表明RDR2缺失功能对于FAD2共抑制是有增强作用的。而在T2代和T3株系中，分别有50%和80%的株系表现出FAD2共抑制解除。因此，在rdr2中FAD2转基因株系传代不稳定说明在rdr2中可能仍然存在对于转基因的表观修饰，而且此表观修饰对于转基因沉默是存在抑制作用的。
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