摘要
微藻通过光合作用能够合成积累不同类型的生物活性物质，它们已成为营养品、化妆品和药品的重要资源。原种名为缺刻缘绿藻（Parietochloris incisa SAG2468）、缺刻叶球藻（Lobosphaera incisa CAUP H4301）和双隔蚁形藻（Myrmecia bisecta SAG2043）的三株球状绿藻均隶属于绿藻门（Chlorophyta）、共球藻纲（Trebouxiphyceae），三者形态极为相似，均能在一定培养条件下，尤其是胁迫条件下积累高含量的油脂和花生四烯酸（AA），然而三者的分类地位较为模糊。本研究首先结合显微形态、超微形态及分子系统学的方法对其进行分类鉴定，然后对藻株进行评价和优化，探究多因素组合条件下不同营养因子（mBG-11培养基中不同氮源和氮浓度、不同初始氮、磷和硫浓度、CO2浓度及培养基类型）和光生物反应器的光径大小对生长、油脂及AA积累的影响，最后从转录组学的角度解析氮饥饿模式下3株微藻油脂和AA积累差异性的分子特征。 结果表明，修订后3株微藻均隶属于叶球藻属（Lobosphaera），缺刻缘绿藻（Parietochloris incisa SAG2468）应修订为缺刻叶球藻SAG2468（Lobosphaera incisa SAG2468），与缺刻叶球藻CAUP H4301（Lobosphaera incisa CAUP H4301）为缺刻叶球藻的不同地理株系，双隔蚁形藻（Myrmecia bisecta SAG2043）应修订为双隔叶球藻SAG2043（Lobosphaera bisecta SAG2043）。营养盐调控方式对3株微藻生长、油脂及AA积累有显著影响，不同氮源和氮浓度对3株微藻生长、油脂和AA积累的影响实验结果表明，硝酸钠、尿素比铵盐更适合3株微藻的生长，低氮胁迫（3mmol/L）能显著促进油脂和AA积累。不同浓度的氮、磷和硫耦合诱导模式实验结果表明，双隔叶球藻SAG2043较另外两株微藻生长更快，更具有油脂和AA开发潜力，加富磷、硫有利于该藻的生长，低氮胁迫（3mmol/L）相较低磷（0.029mmol/L）、低硫（0.038mmol/L）胁迫对油脂和AA的促进作用最显著，且优于多种营养盐胁迫。低氮（3mmol/L）富磷（0.46mmol/L）富硫（0.6mmol/L）耦合诱导模式下可达到最高的油脂及AA产率，分别为177.21和44.46mg/(L·d)，对应的生物量为6.3g/L，油脂及AA含量分别为40.8%和10.59%。 1%CO2和mEndo培养基最有利于双隔叶球藻SAG2043的生长和AA积累，同时以低氮浓度（3mmol/L）的尿素为氮源，能获得最高的油脂及AA产率，分别达到170.39和41.75mg/(L·d)，对应的生物量为6.50g/L，油脂及AA含量为39.34%和9.64%。与4.5cm和6cm光径相比，较小光径（3cm）能显著促进双隔叶球藻SAG2043的生物量积累，尤其在氮浓度为18mmol/L的mEndo培养基中，生物量高达10.58g/L，是正常mBG-11培养基的近2倍。伴随生物量的快速积累，最终油脂和AA产率也达到最高，分别为245.66和73.41mg/(L·d)，是正常mBG-11培养基的2倍和2.66倍，对应的油脂和AA含量分别为34.82%和10.41%。 通过RNA-Seq技术，对三株微藻全氮及缺氮条件下脂质代谢途径相关基因的差异表达情况进行比较分析，重构了3株微藻主要脂质代谢网络，包括脂肪酸的从头合成以及多不饱和脂肪酸（PUFAs）、叶绿体脂质（主要是MGDG）和三酰甘油（TAG）的合成代谢途径，三株微藻主要以ω6途径合成AA。无氮条件下，上游如C4-like的CCM途径和PDHC途径活跃上调，可能起到增补碳流和还原力的作用，将更多的前体Acetyl-CoA推入脂肪酸的从头合成；中下游脂肪酸从头合成途径上调及MGDG合成途径下调，富集更多脂酰基用于甘油酯组装，TAG合成途径整体上调，这种多层次的调控确保了碳流转向油脂合成的效率，促使TAG不断积累。相对而言，双隔叶球藻SAG2043在上述过程中响应氮胁迫的基因拷贝数更多，转录表达水平也较活跃，上调趋势更显著。PUFAs合成途径中去饱和酶和延长酶等关键酶大幅上调，同时上游脂肪酸从头合成途径中扮演“牵引”和“输出”作用的相关基因上调为PUFAs的合成奠定物质基础，极大的促进AA的积累。相较于另外两株微藻，缺刻叶球藻SAG2468在AA合成途径的基因拷贝数、转录表达丰度及上调趋势更显著。 总体来说，双隔叶球藻SAG2043有较强的光合效率和抗胁迫能力，生长快、易培养、易沉降，能获得具有竞争力的油脂和AA含量及产率，有望成为大规模生产AA的植物新资源。
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