摘要
CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9)系统作为一种新的基因编辑工具，其操作简单、成本低、周期短，正在被广泛研究和应用，目前已经成功实现了在水稻、小麦、拟南芥、本生烟草、苹果、香蕉、小鼠等生物中的基因定点编辑。近两年CRISPR系统在葡萄上也得到了成功的应用，但尚不成熟。 本试验利用CRISPR/Cas9技术对‘无核白’葡萄(Vitis vinifera cv.Thompson Seedless)的VvOEE2基因和VvPDS1基因进行定点敲除，以期望获得基因编辑的‘无核白’葡萄植株。主要结果如下： 1.利用双子叶植物基因编辑载体pP1C.4和pYLCRISPR/Cas9成功构建重组质粒：pP1C.4-OEE2-2、pP1C.4-PDS1-1、pP1C.4-PDS1-2、pYL-OEE2-15，利用这四个重组质粒分别转化‘无核白’葡萄体细胞胚，经过筛选培养，依次获得80、0、63、13株抗性植株，通过对抗性植株的靶序列测序分析，并未检测到靶点的突变。 2.利用基因编辑载体pJim19、pCambia1300成功构建了重组质粒pJim-OEE2-1、p Jim-OEE2-2、pJim-PDS1-1、pJim-PDS1-2、pCambia-OEE2-1、pCambia-OEE2-2、pCa mbia-PDS1-1、pCambia-PDS1-2并瞬时转化‘无核白’葡萄原生质体，在荧光显微镜下观察到了发出绿色荧光的原生质体，证明质粒成功转化进入原生质体。测序后并未发现靶点序列的突变。推测是由于原生质体制备过程中，完好的原生质体数量太少导致转化效率降低。利用质粒pCambia-OEE2-1、pCambia-OEE2-2、pCambia-PDS1-1、pCamb ia-PDS1-2瞬时转化‘无核白’葡萄叶片，在转化叶片中检测到了靶点P.OEE2-1的单个碱基突变。
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