摘要
随着人类社会逐渐进入老龄化，骨质疏松症的患病率也逐年增加。骨质疏松是一种全身性骨骼疾病，患病人群骨代谢出现异常，骨密度降低，最终导致骨折风险增加。成骨细胞和破骨细胞是骨重塑的基本调控单元，二者协同作用共同维持骨的动态平衡。如果破骨细胞主导的骨吸收增加，而成骨细胞介导的骨形成不足，就会打破这种平衡而引发骨质疏松。因此，从成骨细胞-破骨细胞偶联作用入手，探寻抑制破骨细胞吸收和/或促进成骨细胞形成的活性化合物，是开发抗骨质疏松药物的重要途径。 传统中药在骨质疏松的防治过程中发挥着重要的作用，其中蕴藏着大量具有生物活性的化学成分，是人们发掘活性化合物、先导化合物和临床药物的宝库。桑白皮为桑科植物桑Morus albaL.的干燥根皮，富含多种黄酮类成分。课题组前期研究发现桑白皮具有较好的抑制破骨细胞形成的活性，提示其具有抗骨质疏松的潜力。本文对桑白皮进一步开展研究，以破骨细胞和成骨细胞作为体外活性筛选模型，以期从桑白皮中挖掘出具有抗骨质疏松活性的天然化合物，并对其作用机制进行研究探讨。在此基础上，通过骨质疏松动物模型对化合物的体内活性进行评价，为开发抗骨质疏松药物提供技术支撑。本论文的主要工作如下： （一）桑白皮提取物对成骨细胞和破骨细胞活性的作用研究 采用回流提取法分别制备桑白皮水提物W及醇提物E，通过大孔树脂和聚酰胺柱层析对醇提物中黄酮成分进一步富集，得到纯化提取物R和PA。采用可见分光光度法测定提取物中的黄酮含量，结果黄酮含量为：PA＞R＞E＞W。MTT法增殖试验结果表明，四种提取物均能促进MC3T3-E1Subclone14的增殖，且促增殖作用随黄酮含量增加而增强。研究并确定了MC3T3-E1Subclone14体外诱导成骨细胞模型的条件，ALP活性测定结果显示，提取物E、R及PA对成骨细胞的分化有明显促进作用。采用原代分离骨髓细胞并以1α,25-(OH)2VitD3进行体外诱导培养的方法构建破骨细胞模型，并以此研究提取物对破骨细胞的活性作用。结果显示四种提取物在一定剂量范围内，与空白对照组相比，TRAP阳性细胞个数明显减少，具有抑制破骨细胞形成的作用。 （二）桑白皮中活性单体化合物的筛选研究 进一步选择15个源于桑白皮的单体化合物开展抗骨质疏松活性研究，其中8个为黄酮类成分，另外7个分属二苯乙烯及其糖苷类、苯骈呋喃类、香豆素类、生物碱类、五环三萜类化合物。活性筛选研究发现，桑白皮中黄酮类成分的活性整体上要优于非黄酮类成分。在8个黄酮类成分中，桑根酮C、桑根酮D、桑黄酮、桑辛素、桑黄酮G、桑皮酮H、摩鲁新L这7个化合物既对MC3T3-E1Subclone14有促增殖作用，同时又对破骨细胞的形成有不同程度的抑制作用。在7个非黄酮类成分中，白黎芦醇、氧化白黎芦醇对破骨细胞的形成有抑制作用，而其余5个化合物则对破骨细胞的形成有不同程度的促进作用。 （三）桑根酮C和桑根酮D对破骨细胞的影响及其作用机制研究 桑根酮C（SC）和桑根酮D（SD）互为立体异构体，为桑白皮中主要的异戊烯基黄酮类成分。对破骨细胞的活性研究表明，SC和SD实验组TRAP阳性细胞计数和骨磨片骨吸收陷窝面积均明显减少，说明二者皆可抑制骨髓细胞向破骨细胞的分化，并能降低破骨细胞的骨吸收活性。为了进一步探讨其作用机制，选择TRAF6、NFATc1、TRAP、CTSK、MMP9等骨代谢相关基因进行研究。Real-time PCR和Western Blotting研究结果发现，SC和SD均可下调TRAF6、NFATc1、TRAP、CTSK mRNA水平和TRAF6、CTSK的蛋白表达。 （四）桑根酮C和桑根酮D对成骨细胞的影响及其作用机制研究 采用MTT法考察SC和SD对MC3T3-E1Subclone14细胞的作用，结果SC和SD对成骨细胞均有明显的促增殖作用，且随着浓度的增加，促增殖作用依次增强。ALP是成骨细胞早期分化的标志物，矿化结节的形成则处在成骨细胞分化的最后阶段。ALP测定及矿化结节茜素红染色结果表明，一定浓度范围的SC和SD皆可促进成骨细胞的分化和矿化。为了进一步探讨其作用机制，选择Runx2、Collagen I、Osteopontin、β-catenin、OPG和RANKL等成骨相关基因进行研究。Real-time PCR和Western Blotting研究结果发现，SC和SD均能上调β-catenin、Runx2、Collagen I、Osteopontin的mRNA和/或蛋白表达水平，SC还能上调OPG/RANKL的mRNA和蛋白表达水平。 （五）桑根酮C和桑根酮D对泼尼松诱导的斑马鱼骨质疏松的影响 采用泼尼松诱导正常斑马鱼构建的骨质疏松症模型，对SC和SD的体内抗骨质疏松活性进一步开展研究。结果发现，与模型对照组相比，SC（1μM、3μM、10μM）和SD（0.1μM、0.3μM、1μM）能显著增加斑马鱼脊椎骨的累积光密度值，且SC在10μM时对骨矿化的改善率与阳性对照药依替膦酸二钠相当。结果表明，SC和SD能够逆转泼尼松诱发的骨丢失，提高骨密度。 综上，通过对桑白皮提取物及系列单体化合物的研究，发现桑白皮中的异戊烯基黄酮类成分SC和SD具有较好的活性。SC和SD在体外细胞模型和体内动物试验均表现出了较好的抗骨质疏松特性，本论文研究推断其抗骨质疏松作用机制为：（1）SC和SD对破骨细胞的抑制作用，可能是作用于RANKL/RANK信号途径，通过调控TRAF6、NFATc1继而引起破骨细胞标志性基因TRAP、CTSK的下调。（2）SC和SD促进成骨细胞的增殖分化，可能是通过Wnt/β-catenin信号通路激活Runx2的表达，继而上调Collagen I、Osteopontin的表达。
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