摘要
卡瓦胡椒(Piper methysticum G.Forst)是太平洋岛屿上的一种传统作物，在太平洋地区被广泛食用。大量的研究发现，太平洋岛国的前列腺癌和肺癌的发病率较低，人们推测群体中较低的癌症发病率可能与他们饮食卡瓦胡椒有关。Flavokawain A(FKA)是植物卡瓦胡椒中的一种新型查尔酮类化合物，已有研究报道其对乳腺癌、膀胱癌、前列腺癌等多种肿瘤细胞有显著的抑制作用，且对正常细胞损害较小。前列腺癌(PCa)是男性最常见的泌尿生殖系统恶性肿瘤，美国2019年肿瘤统计报告显示，前列腺癌在男性中的新增发病率居首位，死亡率排名第2。近年来，我国中老年人口中前列腺癌的发病率呈现明显持续增长态势，前列腺癌的预防及治疗引起了人们的极大关注。 目的: 本课题主要研究FKA对前列腺癌细胞株PC3的抑制作用，并对其分子机制进行探究。 方法: (1)采用MTT法检测FKA对PC3细胞增殖的影响; (2)采用流式细胞术分析FKA对PC3细胞凋亡及周期的影响; (3)通过蛋白质免疫印迹实验(Western blot)测定FKA对细胞周期相关蛋白β-tubulin及Survivin表达的影响; (4)采用免疫荧光检测FKA对微管蛋白β-tubulin分布的影响，通过分子对接模拟分析FKA与β-tubulin的结合情况; (5)利用代谢组学技术研究FKA对PC3细胞代谢产物和代谢通路的影响，并研究前列腺癌与癌旁组织之间代谢物及代谢通路的差异; (6)结合生物信息学工具，查询前列腺癌中差异表达的基因，并与前列腺癌组织与癌旁组织间的差异代谢物联合进行分析，分析FKA抑制前列腺癌的作用机制; (7)通过ELISA实验检测FKA对谷胱甘肽代谢途径中还原型谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽合成酶(GSS)、谷胱甘肽S转移酶(GSTP1)的影响; (8)采用流式细胞术检测FKA对PC3细胞内活性氧(reactive oxygen species，ROS)含量的影响。 结果: (1)MTT结果显示:FKA以1.56μM、3.12μM、6.25μM、12.50μM、25.00μM、50.00μM及100.00μM的浓度分别作用于PC3细胞，48h时，IC50值为50.05μM;72h时，IC50值为22.86μM。通过不同时间测定FKA对PC3细胞增殖的抑制作用，可以看出FKA对PC3细胞的增殖抑制作用呈时间和浓度依赖性。MTT实验结果表明FKA可以有效地抑制人前列腺癌PC3细胞的增殖。 (2)流式细胞术结果显示:①FKA作用于PC3细胞后，细胞凋亡率与FKA浓度呈正相关，②FKA作用于PC3细胞后可将细胞阻滞于G2/M期。 (3)Western blot结果显示:FKA可增加β-tubulin蛋白的表达，并且可显著性降低Survivin蛋白的表达。 (4)免疫荧光结果显示:FKA处理PC3细胞后，细胞形态发生变化，微管蛋白的分布出现混乱，微管结构出现紊乱及模糊现象。分子对接模拟分析表明FKA可以停靠在秋水仙碱结合位点，发挥抗微管蛋白聚合的活力。 (5)代谢组学结果表明:FKA作用于PC3细胞后，细胞内29种内源性代谢物含量发生显著性变化，对差异化合物进行通路分析发现谷氨酰胺及谷氨酸的代谢、谷胱甘肽代谢等多条代谢通路发生改变;前列腺癌与癌旁组织之间检测到11个差异化合物，对差异化合物进行通路分析发现其对谷胱甘肽代谢在内的多条代谢通路均有影响。 (6)通过生物信息学手段查找出前列腺癌中622个差异表达的基因，将差异基因分别与前列腺癌与癌旁组织间的差异代谢物进行联合分析，发现谷胱甘肽代谢发生显著性变化。 (7)对谷胱甘肽代谢途径中的代谢物及酶活性进行检测，发现FKA可能通过改变谷胱甘肽代谢途径中的代谢物及酶活性抑制谷胱甘肽代谢。 (8)ROS含量测定结果表明:随着FKA给药浓度的增加，细胞内ROS含量逐渐增加。 结论: (1)FKA通过干扰微管蛋白的聚合，改变微管相关蛋白tubulin及Survivin的表达，影响到纺锤体的功能，诱导G2/M期的阻滞，从而导致PC3细胞的死亡。 (2)FKA可以抑制前列腺癌PC3细胞谷胱甘肽代谢途径，细胞抗氧化应激能力降低，同时PC3细胞中ROS的含量增加，导致氧化应激，诱导细胞凋亡。
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