摘要
肺癌在全球癌症中的发病率和死亡率居高不下。2018年，新诊断出210万例肺癌病例，预计有180万例死亡，其中80％的肺癌是非小细胞肺癌，包括肺腺癌(50-60％)和肺鳞状细胞癌(30％)。尽管靶向治疗和免疫治疗在肺癌治疗中发展迅速，但目前肺癌的5年生存率仍然很低。因此迫切需要阐明肺腺癌发病的相关机制。FTO是首次通过全基因组关联研究(GWAS)确定与肥胖风险增加相关的疾病。目前研究发现FTO是一种m6A去甲基化修饰酶。而m6A的去甲基化修饰与肺癌发病机制密切相关。研究表明FTO在非小细胞肺癌，胃癌，宫颈癌，胰腺癌和急性髓性白血病等多种癌症中大量表达。但FTO与肺腺癌的相关研究目前尚未报道。在本研究中，试图探讨FTO和肺腺癌的预后作用。通过数据挖掘TCGA数据库，首先确定了FTO表达水平与肺腺癌之间的关系。然后在体外构建细胞模型，探索FTO在肺腺癌细胞A549和H1299中的功能作用。最后，通过mRNA测序进一步研究FTO在肺腺癌中的潜在分子机制。 第一部分 FTO在肺腺癌中表达水平 目的： 分析FTO在肺腺癌组织中的表达水平及FTO与肺腺癌的关系。 方法： 在人蛋白图谱门户网站(http：//)上分析FTOmRNA和蛋白在不同组织中的表达水平。通过UALCAN(http：//ualcan.path.uab.edu/index.html)分析了TCGA队列中LUSC和LUAC中FTO表达水平和生存比例的关系。 结果： 1.从人类蛋白质图谱门户网站公布的数据显示，FTO在肺组织中高表达，甚至比在脂肪组织表达量更高。 2.UALCAN数据显示，FTO在肺鳞癌和肺腺癌中表达量低于癌旁组织。 3.FTO下调与肺腺癌存活率降低显著相关，但与肺鳞癌存活率无关。 结论： FTO在肺腺癌组织中低表达，且FTO的表达水平与肺腺癌的预后相关。 第二部分 不同FTO表达水平的肺腺癌细胞构建及鉴定 目的： 在人肺腺癌细胞A549和H1299细胞中建立FTO过表达、R96Q过表达模型及FTO下调的模型。 方法： 利用FTO过表达、R96Q过表达模型及FTO下调慢病毒载体感染A549和H1299细胞，利用qRT-PCR和Western blot进行验证。 结果： 1.在A549和H1299细胞中，与对照组相比，FTO过表达、R96Q过表达组的FTOmRNA表达明显升高;而FTO下调组的FTOmRNA明显下降(P＜0.05)。 2.在A549和H1299细胞中，与对照组相比，FTO过表达、R96Q过表达组的FTO的蛋白表达明显升高;而FTO下调组的FTO的蛋白明显下降(P＜0.05)。 结论： 在人肺腺癌细胞A549和H1299细胞中成功构建FTO过表达、R96Q过表达模型及FTO下调的模型。 第三部分 FTO去甲基化对肺腺癌细胞生物学行为影响的实验研究 目的： 探讨FTO去甲基化对肺腺癌细胞的增殖、迁移、侵袭及凋亡的影响。 方法： 采用CCK8实验、划痕实验及Transwell小室实验检测细胞的增殖、迁移及侵袭能力变化。采用流式细胞技术检测细胞的细胞凋亡水平。使用m6A半定量试剂盒检测细胞RNA中m6A含量。 结果： 实验结果显示：FTO过表达能促进细胞的增殖、迁移、侵袭和凋亡能力。相反，FTO下调能抑制细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡能力。m6A结果显示，与对照细胞相比，FTO过表达导致细胞中m6A表达增加，而FTO过表达降低m6A的表达水平。FTO的去甲基化酶活性是肺癌细胞生长、存活和侵袭所必需的。为了进一步验证肺腺癌中FTO的去甲基化酶活性，构建R96Q突变模型。 结果发现，过表达R96Q能抑制细胞的增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响，同时R96Q过表达对降低细胞m6A水平没有影响。因此，该结果表明FTO基因由于其去甲基化酶活性而对肺癌的作用紧密。 结论： FTO去甲基化在肺腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭中起关键作用。 第四部分 RNA测序分析 目的： 探讨FTO去甲基化对肺腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭作用的机制。 方法： 对细胞进行RNA测序分析。将测序结果进行生物信息学GO富集分析、KEGG分析。探讨SPARC在A549细胞的表达水平。 结果： 1.测序结果显示500个基因显著表达，其中244个基因上调和256个下调。 2.GO富集分析，分别在细胞组分(CC)，分子功能(MF)和生物过程(BP)组中鉴定了11，15和13类。 3.KEGG分析，在FTO过表达组和R96Q过表达组之间鉴定了总共204个具有差异表达的途径，其中20个途径显示出显着差异(P＜0.05)。这些途径主要与肿瘤细胞的转移和侵袭有关。 4.发现ILlB，FN1，PTGS2，MMP2，SPARC，TLR4，ITGA2，APOE，BMP4和STAT1基因可能是肿瘤细胞转移的主要参与者，通过筛选，选定SPARC为我们的目的基因。 5.FTO的过表达增加了SPARC在A549肺癌细胞上的表达，并且R96Q的过表达降低了A549肺癌细胞上SPARC的表达。 结论： SPARC可能是肺腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭作用的主要调控因子之一。
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