摘要
目的：1.探讨裂果薯皂苷Ⅰ(SPHSⅠ)和裂果薯皂苷Ⅱ(SPHSⅡ)对人肝癌HepG2和BEL-7402细胞自噬的影响，并对其分子机制进行初步探究。2.进一步研究SPHSⅠ调节自噬的机制，并评估该自噬机制是否影响其凋亡。3.评估联用SPHSⅠ与阿霉素体外治疗肝癌的协同效果，探讨SPHSⅠ对癌细胞营养饥饿的耐受性的影响。 方法： 第一部分实验方法：(1)采用MTT法检测SPHSⅠ和SPHSⅡ对人肝癌HepG2和BEL-7402细胞的增殖抑制作用。(2)采用Western blotting检测SPHSⅠ和SPHSⅡ对HepG2和BEL-7402细胞自噬相关蛋白表达的影响，经氯喹(CQ)处理后再次测定上述指标。(3)采用Lyso-Tracker Red染色、MagicRed Cathepsin B染色观察SPHSⅠ和SPHSⅡ对HepG2和BEL-7402细胞自噬的影响，经自噬激活剂雷帕霉素(Rapa)、PP242处理后再次测定上述指标。第二部分实验方法：(1)采用Western blotting检测SPHSⅠ对人肝癌HepG2和BEL-7402细胞对溶酶体功能相关蛋白、自噬相关蛋白、凋亡相关蛋白、mTOR信号通路以及MAPK信号通路蛋白表达的影响，经雷帕霉素(Rapa)、N-乙酰半胱氨酸(NAC)或U0126处理后再次测定上述指标。(2)采用透射电镜观察SPHSⅠ对HepG2细胞的超微形态特征的影响。(3)采用Lyso-Tracker Red染色、Magic Red Cathepsin B染色观察SPHSⅠ对HepG2和BEL-7402细胞自噬的影响，经U0126处理后再次测定上述指标。(4)SPHSⅠ对HepG2和BEL-7402细胞凋亡形态的影响，采用Hoechst33258染色法观察，经U0126处理后再次测定上述指标。第三部分实验法：(1)采用Western blotting检测SPHSⅠ联用阿霉素对人肝癌HepG2和BEL-7402细胞对自噬相关蛋白的影响。(2)采用MTT法检测SPHSⅠ联用阿霉素对人肝癌HepG2和BEL-7402细胞的协同增殖抑制作用。(3)采用流式细胞仪检测SPHSⅠ及营养饥饿对人肝癌HepG2和BEL-7402细胞凋亡的影响。 结果： 第一部分实验结果： (1)SPHSⅠ和SPHSⅡ可抑制人肝癌HepG2和BEL-7402细胞增殖并抑制细胞自噬，引起自噬标志性蛋白LC3-Ⅰ转变为LC3-Ⅱ，p62蛋白表达没有显著变化或有增加趋势。 (2)加入溶酶体抑制剂氯喹后，SPHSⅠ和SPHSⅡ未能进一步提高用氯喹处理的细胞中的LC3-Ⅱ的水平。 (3)在用PP242、雷帕霉素处理的细胞中可观察到Lyso-Tracker Red染色的红色荧光显著增加，在与裂果薯皂苷的共同处理组中消除了该荧光增强效果，且溶酶体组织蛋白酶B特异性染料Magic Red Cathepsin B的红色荧光亦呈现相同变化。 第二部分实验结果： (1)Western blotting检测结果表明，SPHSⅠ可通过抑制溶酶体膜蛋白和下调溶酶体组织蛋白酶的表达来抑制溶酶体蛋白水解活性阻断人肝癌BEL-7402细胞自噬体-溶酶体融合; (2)增加人肝癌HepG2和BEL-7402细胞p62蛋白表达，并逆转雷帕霉素减少p62表达的作用;增加LC3-Ⅱ蛋白表达，并在Rapa的基础上进一步增加LC3-Ⅱ蛋白表达，进一步验证了SPHSⅠ抑制人肝癌HepG2和BEL-7402细胞自噬的抑制作用。在与自噬激活剂雷帕霉素共同的条件下与SPHSⅠ单独作用组相比，SPHSⅠ引起的凋亡蛋白Caspase-3、Caspase-9总蛋白表达下降、活性增加的结果被逆转，提示SPHSⅠ抑制人肝癌HepG2和BEL-7402细胞自噬对其诱导的凋亡起到促进作用。 (3)再进一步Western blotting实验表明，SPHSⅠ显著抑制人肝癌HepG2和BEL-7402细胞P-Akt蛋白，以及mTOR通路下游蛋白P-4E-BP1、P-S6的表达。表明SPHSⅠ并非通过激活PI3K-AKT-mTOR信号通路抑制自噬。 (4)当ROS的增高被NAC阻断，或Erk的磷酸化被U0126阻断后，SPHSⅠ的自噬抑制作用被逆转，表现为与SPHSⅠ单独作用组比较LC3-Ⅱ与p62蛋白表达下降。同时，在SPHSⅠ引起的自噬抑制效果被Erk抑制剂U0126逆转的情况下，SPHSⅠ与U0126共同作用的条件下与SPHSⅠ单独作用组相比，SPHSⅠ引起的凋亡蛋白Caspase-3、Caspase-9总蛋白表达下降、活性增加的结果被逆转。 (5)Lyso-Tracker Red染色、Magic Red Cathepsin B染色实验结果表明Erk抑制剂U0126能逆转SPHSⅠ对人肝癌HepG2和BEL-7402细胞自噬抑制作用，进一步验证了MAPK/ERK信号通路参与SPHSⅠ对人肝癌HepG2和BEL-7402细胞自噬的调控。 (6)通过Hoechst33258染色法观察到SPHSⅠ能诱导人肝癌HepG2和BEL-7402细胞凋亡并出现染色质固缩、细胞核呈致密浓染或呈碎块状致密浓染，颜色发白等形态学变化。在与U0126共同作用的条件下，SPHSⅠ诱导凋亡的效果减弱。 (7)透射电镜结果表明SPHSⅠ可诱导人肝癌HepG2细胞出现核碎裂、染色质浓度和细胞收缩等细胞凋亡的特征并可观察到细胞质中空泡样结构的积聚和一些自噬体的形成，但是没有观察到自噬溶酶体。 第三部分实验结果： (1)Western blotting实验结果表明，在实验剂量下，阿霉素能逆转SPHSⅠ的自噬抑制作用，联用表现为自噬激活效果，二者对自噬的影响相互拮抗。 (2)本研究中采用小剂量SPHSⅠ配合阿霉素梯度浓度的单药或双药不同组合，依次分别作用于人肝癌HepG2和BEL-7402细胞，通过分析和计算，显示SPHSⅠ和阿霉素具有协同抗癌作用。 (3)利用Earle's平衡盐溶液(EBSS)饥饿处理细胞后，裂果薯皂苷诱导的细胞凋亡进一步增加。 结论：1.SPHSⅠ和SPHSⅡ可抑制人肝癌HepG2和BEL-7402细胞增殖和自噬。2.SPHSⅠ可使BEL-7402和HepG2细胞自噬-溶酶体融合过程受阻，从而抑制其自噬。SPHSⅠ通过激活MAPK/ERK信号通路抑制人肝癌HepG2和BEL-7402细胞自噬并诱导其凋亡。3.SPHSⅠ和阿霉素具有协同抗癌作用。饥饿显著增加人肝癌HepG2和BEL-7402细胞对SPHSⅠ诱导的细胞凋亡的敏感性。
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