摘要
盐、干旱、低温等非生物逆境胁迫严重影响农作物的产量和农产品品质，研究植物耐／抗非生物逆境胁迫的分子生物学机理，提高作物耐（抗）非生物逆境特性，对确保农作物高产、稳产显得尤为重要。蛋白质的泛素化修饰是细胞生命活动过程中最重要的调控机制之一，已有研究表明，蛋白质的泛素化修饰参与了植物的生长发育过程以及对生物胁迫和非生物胁迫的响应。本文通过分子生物学、生物化学和遗传学等的技术手段，对水稻RING型E3泛素连接酶基因ZF/P/(ZFP182 Interacting Protein 1)和ZFRG/(ZFP252 Regulated Gene 1)的功能进行研究。主要结果如下： 以qRT-PCR方法分析了ZFIP1基因在水稻成株期不同组织中的表达和苗期不同非生物逆境诱导表达特性，结果表明，ZFIP1在水稻的各个组织中均有表达，其中在根、穗和节中的表达量相对较高，在茎和叶中的表达量较低；ZFIP1的表达受盐胁迫（100 mM NaCl）、渗透胁迫(20% PEG)、ABA( 50 μM ABA)、氧化胁迫(100 mM H2O2)和低温(4℃)胁迫的诱导，但受高温(42℃)胁迫的负调控。pZFIP1:GUS转基因植株的GUS染色分析表明，ZFIP1在幼根，幼穗和节中表达量较高。体外泛素化实验结果表明，ZFIP1蛋白具有E3泛素连接酶活性，在E1、E2及泛素(ubiqutin)存在下能自身泛素化，C3H2C3类型RING finger结构域的完整对其E3泛素连接酶活性是必须的。水稻原生质体转染实验结果显示ZFIP1定位在细胞核和细胞质中。利用酵母单杂交体系进行转录活性分析，结果表明ZFIP1蛋白在酵母体内有很强的转录自激活活性，缺失实验分析表明，RING环结构域对于转录活性是必须的。水稻原生质体内瞬时转录激活检测实验也证实ZFIP1具有激活报告基因LUC表达的转录激活活性。 通过农杆菌介导的方法获得了ZFIP1过表达和RNAi干扰抑制表达的转基因株系，对其生物学功能进行研究，结果表明，ZFIP1过表达的转基因植株降低了对ABA敏感性、耐冷性及耐氧化胁迫性，提高了盐胁迫敏感性；RNAi干涉的转基因植株则相反，增强了对ABA敏感性、耐冷性及耐氧化胁迫性，降低了盐胁迫敏感性。在冷胁迫处理下，ZFIP1-RNAi干涉转基因植株较野生型能提高过氧化物酶POD( Peroxidase)、过氧化氢酶CAT( Catalase)、总超氧化物歧化酶T-SOD( Total Superoxide dismutase)、总抗氧化能力T-AOC（Total Antioxidant capability）的活力，积累更多的脯氨酸，降低丙二醛MDA( Malondialdehyde)和H2O2的积累；而过表达株系则相反，在胁迫处理时，胁迫相关基因OsP5CS会受到抑制表达。进一步研究ZFIP1参与胁迫调控的作用机制，对ZFIP1过表达植株和对照植株在冷处理前后进行了全基因组表达分析表明，ZFIP1可能在转录水平上通过调节逆境相关基因的表达来调控水稻的非生物胁迫响应过程。 以qRT-PCR方法分析了ZFRG1基因在水稻成株期不同组织中的表达和苗期不同非生物逆境诱导表达特性，结果表明，ZFRG1在水稻成株期的根和幼穗等组织中表达较高，ZFRG1受多种非生物胁迫的诱导表达，包括盐胁迫(100 mM NaCl)、渗透胁迫( 20% PEG)、氧化胁迫(100 mM H2O2)、低温(4℃)、高温胁迫(42℃)、ABA( 50 μM ABA)等。水稻原生质体亚细胞定位和注射烟草瞬时表达实验结果表明，ZFRG1定位于细胞膜上。通过农杆菌介导的转基因技术获得ZFRG1过量及RNAi干涉抑制表达转基因植株，耐逆性鉴定结果表明，过量表达ZFRG1的转基因植株降低了耐盐性及耐旱性，而ZFRG1-RNAi干涉抑制转基因株系提高了耐盐和耐旱性。体外E3活性检测结果说明，ZFRG1具有E3泛素连接酶活性，且完整的RING环结构域对其E3泛素连接酶活性是必须的。利用酵母单杂交体系进行转录活性分析，结果显示在酵母体内ZFRG1不具有转录激活功能。利用酵母双杂交方法筛选ZFRG1的相互作用蛋白，并通过酵母体内和Pull-Down体外方法验证，发现ZFRG1与两个NAC2家族蛋白NAC2和NAC2-like相互作用。NAC2无论与ZFRGI还是RING环结构域中保守氨基酸点突的ZFRG1的酵母共转体在四缺培养基上都能生长，但NAC2-like只与RING环结构域中保守氨基酸点突的ZFRG1酵母共转体在四缺培养基上生长，而转有NAC2-like和ZFRG1的酵母却不能生长。说明NAC2-like很可能是ZFRG1的直接泛素化底物，有活性的ZFRG1与NAC2-like互作后直接把它给降解了。以上结果表明，ZFRG1可能作为E3泛素连接酶在翻译后修饰水平上通过泛素．蛋白酶体途径调控胁迫相关蛋白的降解，参与水稻非生物逆境胁迫的响应。
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