摘要
一、研究背景与目的 哺乳动物的精子发生过程是一个循序渐进的过程，也是一个复杂的形态变化和细胞分化的过程。由初级精母细胞经过一系列减数分裂和形态变化形成成熟精子的过程称为精子发生，形成后的精子在附睾中进一步发育成熟并且获能，成为具有受精能力的生殖细胞。睾丸支持细胞是生精小管中唯一与生精细胞直接接触的体细胞，它不仅起结构上的支持作用，更起着营养与调节的作用。睾丸支持细胞连接而成的特殊结构为血睾屏障，可提供精子正常发生所必需的微环境。支持细胞的骨架结构对于维持其细胞极性，形成血睾屏障与正常精子发生至关重要。目前，调节支持细胞骨架结构的分子机制尚未完全阐明。 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(the mechanistic Target Of Rapamycin，mTOR)是一种高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。其在体内能形成两种不同的复合物，分别是mTORC1（mTOR complex 1）和mTORC2（mTOR complex 2），这二者接受不同的上游信号，调节不同的生理功能。mTORC1由mTOR、Raptor、Deptor、PRAS40和mLST8组成，对短期的雷帕霉素处理敏感。mTORC2与mTORC1 一样含有mTOR和mLST8，但它也含有另外三个独有的成员：Rictor，mSin1和PRR5/Protor。尽管两者均含有部分共同的成员，但mTORC2对短期的雷帕霉素处理不敏感。相对于mTORC1，mTORC2的功能与调节机制了解较少，目前公认的是它能使下游蛋白Akt的丝氨酸473位点(Ser473)磷酸化而控制细胞的存活。另外，Rictor是调控actin的重要上游因子，可通过PKC及小GTP酶Rac1或Rho等调控actin，进而控制整个细胞骨架的组装和动态平衡。 雷帕霉素(Rapamycin)是mTORC1的特异性抑制剂，它作为免疫抑制剂广泛应用于器官移植病人，用以抑制免疫排斥反应。随后发现长期服用雷帕霉素的男性病人的精子数量明显减少，有些甚至出现无精症，男性生育能力明显下降。这表明mTOR在男性生殖能力中起着重要的调控作用。但是，mTOR的作用靶点尚不清楚，是直接作用于生精细胞本身，还是通过干预睾丸支持细胞或间质细胞的功能间接影响精子发生尚不明确。 文献报道，mTORC1在精子发生中起着重要的调控作用，但mTORC2在血睾屏障形成和精子发生中的作用不明了。最近有研究发现mTORC2的关键成员Rictor与参与血睾屏障形成的关键蛋白如Occludin、ZO-1和actin等存在共定位，当在体外培养的原代睾丸支持细胞中应用siRNA下调Rictor蛋白的表达后，体外细胞的微丝网络受到一定程度的干扰。但是，该研究并未报道体内Rictor蛋白表达异常对睾丸功能和雄鼠生殖能力的影响，也缺乏充足的动物实验进一步阐明Rictor/mTORC2对血睾屏障和精子发生的调控功能和机制。 本文通过Cre-loxP重组酶系统，构建睾丸支持细胞Rictor基因敲除的小鼠，结合血睾屏障损伤的动物模型，从分子、细胞与整体水平研究mTORC2在睾丸支持细胞骨架结构维持和细胞极性形成、血睾屏障形成、睾丸发育和精子发生与成熟中的作用，进一步探讨mTORC2通过微丝体系调控血睾屏障形成和精子发生的分子机制，为精子发生的调控机制提供新内容，为精子发生障碍相关疾病的防治提供依据和潜在靶点。 二、研究方法 1、应用Cre-loxP系统（Rictor-loxp、Amh-cre）构建睾丸支持细胞特异性Rictor基因敲除小鼠。应用PCR和琼脂糖凝胶电泳进行小鼠基因型的鉴定，用western blot和免疫组织化学确定敲除效果。 2、通过HE染色、免疫组织化学以及免疫荧光技术分析Rictor/mTORC2对小鼠睾丸和附睾组织形态和结构的影响。 3、通过TUNEL检测Rictor/mTORC2对小鼠睾丸生精小管凋亡的影响。 4、通过对敲除小鼠血液进行生化分析，检测Rictor/mTORC2对小鼠血清激素变化的影响。 5、通过流式细胞技术检测Rictor/mTORC2对小鼠睾丸生精小管细胞周期的影响。 6、通过免疫荧光技术、western blot技术、Pulldown以及免疫共沉淀技术分析Rictor/mTORC2对小鼠睾丸支持细胞骨架和睾丸血睾屏障的影响及相关的分子机制。 7、通过给予正常小鼠氯化镉处理，建立睾丸血睾屏障损伤模型，探讨Rictor基因在此模型中作用。 三、研究结果 1、睾丸发育过程中Rictor蛋白在睾丸支持细胞中表达，且氯化镉损伤血睾屏障后Rictor蛋白表达下调 为了探索Rictor/mTORC2在男性睾丸组织中精子发生中的作用，我们首先选取了2周、4周和8周大的正常小鼠，分别检测其睾丸组织生精上皮中Rictor蛋白的表达情况。免疫组织化学(IHC)结果显示，2周大的正常的小鼠，Rictor蛋白主要表达在生精上皮的中间部位，随着睾丸组织的发育，逐渐向生精小管的基底膜部位偏移。而且，生精小管中Rictor蛋白的表达部位与睾丸支持细胞和血睾屏障所在部位相同。Rictor在睾丸组织中周期性表达的特点提示，Rictor基因在睾丸组织的发育过程和功能保持中发挥着重要的作用。氯化镉可通过破坏血睾屏障而导致无精症。为了进一步研究Rictor与血睾屏障的功能维持及精子发生的关系，我们构建了氯化镉处理后导致血睾屏障损伤的小鼠模型。免疫组织化学(IHC)的结果显示，血睾屏障损伤模型的小鼠生精小管的基底膜部位形成大量空泡，附睾组织中无精子生存，两种血睾屏障相关蛋白Occludin和N-cadherin的表达量显著下降。此外，我们发现血睾屏障损伤模型小鼠的生精上皮中Rictor的表达显著下降的同时，FBXW7的蛋白表达量显著升高，这些结果表明睾丸支持细胞中Rictor表达在睾丸支持细胞的正常发育和血睾屏障完整性的维持中具有极其重要的作用。 2、睾丸支持细胞缺失Rictor后导致睾丸和附睾发育障碍 为了进一步研究睾丸支持细胞中Rictor缺失后对生殖系统结构和功能的影响，我们应用Cre-loxP系统(Amh-Cre，Rictor-loxP)在睾丸支持细胞中特异性将Rictor基因敲除，构建了睾丸支持细胞特异性Rictor基因敲除小鼠模型(cKO)。为了验证基因敲除效果，我们应用免疫组织化学(IHC)的方法检测睾丸组织中Rictor的表达情况，敲除鼠的生精小管中几乎完全检测不到Rictor的表达。我们同时应用蛋白免疫印迹(Western blot)方法检测Rictor的蛋白表达水平，发现睾丸支持细胞Rictor特异性敲除小鼠的睾丸中Rictor蛋白的表达水平显著下降。可见，通过Cre-loxP系统，我们成功实现了睾丸支持细胞中特异性敲除Rictor基因。 睾丸支持细胞特异性敲除Rictor基因的小鼠模型成功构建后，我们把研究重点放在生殖器官的结构研究上。虽然敲除鼠与对照同窝鼠的整体外形没有明显差异，但是睾丸和附睾体积和重量都明显变小。敲除鼠睾丸重量仅相当于对照鼠的三分之一(27.6±3.4 mg vs 89.0±0.8 mg，p＜0.01)；附睾重量也是显著低于对照鼠的附睾重量（14.0±1.6 mg vs 24.7±1.1 mg，p＜0.01）。由此，我们可以得出，睾丸支持细胞中特异性敲除Rictor基因后，敲除鼠的生殖器官的外形结构出现严重的缺陷。 既然生殖器官的外形结构出现如此严重的缺陷，那接下来我们开展关于生殖器官内部结构的研究，即睾丸的主要组成部分生精小管的发育是否出现严重的缺陷。睾丸组织切片的苏木精-伊红(HE)染色结果显示，与对照鼠相比，早在1月龄时，敲除小鼠的生精小管形态就开始发生结构紊乱。随着年龄的增长，这种异常越来越明显，生精小管的发育缺陷也越来越严重，尤其是在3月龄以后。生精小管的发育缺陷主要表现在生精小管的内腔的消失、精子细胞的缺失、细胞的聚团，以及整个生精小管的流线形细胞极性的消失。此外，部分生精小管的生精上皮有严重的空泡形成，而部分生精小管则完全无精子的存在。由此可见，睾丸支持细胞缺失Rictor基因后，敲除鼠的睾丸组织的发育出现严重的缺陷，生精小管的完整性与结构均发生严重的破坏。 3、Rictor敲除鼠的生殖器官出现严重发育缺陷与精子发生障碍，表现为无精症 众所周知，睾丸的生精小管发育出现缺陷时，必然引起精子发生的障碍，而且我们的敲除小鼠也出现严重的生精小管的发育缺陷。因此，接下来我们研究敲除鼠的精子发生与生殖能力是否存在异常。我们应用苏木精-伊红染色(HE)方法，处理3月龄和5月龄的附睾组织切片，结果发现对照鼠的附睾中存有大量的形态正常的正常精子，而在敲除鼠的附睾中观察不到精子，只有少许圆形的细胞碎片残留。同时我们计数离体附睾中的精子总数，精子计数证实对照组小鼠附睾中含有大量精子，而敲除鼠的附睾中确实没有精子存在(9.0×106±0.1 vs 0)。此外，我们也做了生殖能力的检测，对照组小鼠和敲除鼠组小鼠各7只，分别与14只C57雌鼠合笼，统计产仔数(108 vs 0)。生殖能力检测也发现敲除鼠不能使雌鼠怀孕，完全丧失了雄性生殖能力。因此，我们可以得到结论，敲除鼠表现为无精症和雄性不育。 精子发生是指由初级精母细胞经过一系列减数分裂和形态变化形成成熟精子的过程，因此我们接着研究是否是因为精子发生过程中发生了阻滞，进而引发了无精症的出现。处于不同时期的生殖细胞所含的染色体倍数是不同的，主要包括一倍体、二倍体和四倍体。因此，我们应用流式细胞仪检测精子发生过程中细胞周期，分析生精上皮中各级生精细胞和体细胞的分布情况，即各个倍数的细胞占细胞总数的比例。结果显示，与对照鼠相比，敲除鼠生精小管中四倍体细胞无显著变化(p＞0.05)，而二倍体细胞显著上升(p＜0.01)，单倍体细胞显著下降(p＜0.01)。因此可得，敲除鼠的精子发生过程中的减数分裂发生异常。同时，我们检测增殖蛋白ki-67和染色单体分离酶蛋白separase的免疫荧光表达，发现敲除鼠和对照鼠没有差异，说明敲除鼠的精子发生中的增殖过程和减数第一次分裂仍然在正常进行。因此可得，Rictor敲除鼠的精子发生阻滞在减数第二次分裂间期或/和减数第二次分裂前期，但生殖细胞的增殖没有差异。 接下来我们应用TUNEL方法检测生精小管中各级细胞的凋亡情况，染色结果发现敲除鼠睾丸的生精小管细胞出现大量凋亡，且呈时间依赖性。与相同月龄的对照鼠相比，一月龄时，敲除鼠已有大量凋亡；三月龄时达到最多，整个生精小管分布着大量的凋亡细胞；五月龄时，因为敲除鼠的生精小管结构已经出现严重缺陷，凋亡细胞反而相对三月龄时有所减少，但数量仍比五月龄的对照组多(p＜0.01)。 精子的发生过程中，激素调节发挥重要的作用，特别是黄体生成素(LH)，卵泡刺激素(FSH)和睾酮(T)，若激素调节异常，则精子的发生可能会出现异常。因此我们还检测对照鼠和敲除鼠血清的三种激素的水平。我们发现对照鼠和敲除鼠的FSH和LH水平无统计学差异(p＞0.05)，但敲除鼠的T水平显著下降(p＜0.01)。因此可见，睾丸支持细胞缺失Rictor基因后睾酮分泌异常、精子生成障碍，说明睾酮水平对精子的发生和生存具有重要作用。 综上所述，睾丸支持细胞Rictor基因的缺失诱发生殖细胞的过度凋亡、睾酮水平下降和精子发生的阻滞，导致了无精症的发生，最终致使敲除鼠完全丧失了生育能力。 4、表现为无精症的支持细胞特异敲除Rictor小鼠，其睾丸生精小管的血睾屏障(BTB)遭到破坏 我们第一部分的结果显示，血睾屏障损伤的小鼠睾丸生精小管的Rictor蛋白表达下降。那睾丸支持细胞敲除Rictor基因后小鼠的血睾屏障是否也会受到影响呢？为了求证敲除鼠血睾屏障的情况，我们用免疫荧光(IF)的方法标记参与血睾屏障形成的关键蛋白的表达与定位情况，这些蛋白包括紧密连接（TJs，Tight Junctions）相关标志蛋白Occludin和ZO-2;特化外质膜相关蛋白(ectoplasmic specialization，ES) β-catenin和N-cadherin;还有肌动蛋白相关蛋白复合物Arpc2 (actin related protein complex 2)。结果显示，在对照鼠中，这些血睾屏障相关蛋白集中表达于生精小管的基底膜处，均匀而规则，与血睾屏障形成的位置以及与Rictor蛋白在生精小管中的表达分布一致，但敲除鼠中相关蛋白的表达则失去了规律性，散乱的分布在整个生精小管，且有向中间管腔部位偏移的趋势。有趣的是，从蛋白免疫印迹(Western blot)的结果分析，除了Arpc2和Occludin的表达有所增加，其他蛋白包括ZO-2、β-catenin和N-cadherin的表达均无明显差异。可见，睾丸支持细胞缺失Rictor基因只是影响了血睾屏障相关蛋白的位置分布，而大部分蛋白的表达量是不受影响的。因此，睾丸支持细胞中Rictor基因的表达，对于维持血睾屏障(BTB)结构完整性和功能发挥中起着至关重要的作用。 5、血睾屏障遭到破坏的Rictor敲除小鼠，其支持细胞极性消失、肌动蛋白骨架结构破坏 睾丸支持细胞是一种具有细胞极性的细胞，细胞核位于靠近基底膜的位置，细胞形态狭长而不规则，贯穿于整个生精上皮。对睾丸支持细胞的特异性标志蛋白william's tumor1 (WT1)进行免疫组织化学染色发现，对照鼠的生精小管中WT1蛋白的定位与睾丸支持细胞的细胞核定位一致，靠近基底膜的周围，而敲除鼠的WT1蛋白则表达在整个生精小管中，且有向中部集中的趋势。由此可见，Rictor缺失后，敲除鼠中睾丸支持细胞的极性受到破坏。 睾丸支持细胞的极性消失，细胞核位置偏移，但整个支持细胞如何变化是未知的。内参蛋白Tubulin和actin在所有细胞中表达，可以反应细胞的整体结构。因此，接下来我们通过免疫荧光(IF)的方法检测细胞骨架蛋白Tubulin和actin的表达。结果显示，Tubulin在正常小鼠的生精小管上皮中均匀分布，且呈现出管周向管腔辐射的特性，与支持细胞的走向一致；而敲除鼠中Tubulin虽然也均匀表达，但已完全丧失方向性，呈无规律的散在分布。同样，在正常小鼠中，actin主要分布于生精小管的基底膜处和近管腔面的精子细胞层处，但在敲除鼠中却与Tubulin 一样呈无规律的散在分布。由此可见，敲除鼠中睾丸支持细胞的极性受到破坏，主要是由于睾丸支持细胞的骨架蛋白表达异常所致。 我们已经知道敲除小鼠的血睾屏障破坏的同时，睾丸支持细胞的细胞骨架破坏、细胞极性消失，但两者的联系是不确定的。因此我们通过免疫共沉淀(Co-IP)的方法，检测睾丸支持细胞Rictor的缺失后，骨架蛋白actin和血睾屏障相关蛋白的连接关系。首先IP法把蛋白actin拉下来，然后用蛋白免疫印迹(Westen blot)检测血睾屏障相关蛋白Occludin和β-catenin的表达情况，结果发现敲除鼠的Occludin和β-catenin的表达下调，说明细胞骨架蛋白与血睾屏障相关蛋白的相互作用明显减弱。睾丸支持细胞敲除Rictor基因后，敲除鼠的细胞骨架蛋白破坏与血睾屏障破坏是关系密切的。 我们已经确定睾丸支持细胞的Rictor基因敲除后，敲除小鼠的支持细胞极性消失、肌动蛋白骨架破坏、血睾屏障破坏，但其机制是未知的。为探讨Rictor是否通过调节下游因子PKCa (S657)和/或Paxillin (Y118)和/或Rac1活性，进而调控血睾屏障的结构完整和肌动蛋白细胞骨架，我们用蛋白免疫印迹(Westen blot)的方法检测PKCα (S657)和/或Paxillin (Y118);用Pulldown方法检测Rac1活性。Westen blot的结果显示，对照组与敲除组的p-PKC(S657)及本底PKCα均没有显著差异，而敲除鼠中p-Paxillin (Y118)的表达量显著下降。Pulldown的结果显示，对照鼠和敲除鼠的裂解上清液中Rac1的表达没有显著差异，而敲除鼠中GTP-Rac1的表达下降。因此，Paxillin和Rac1确实参与了睾丸支持细胞中Rictor/mTORC2调控细胞骨架蛋白平衡和血睾屏障的构建过程。 综上所述，Rictor/mTORC2对整个微丝网络具有重要的调控作用，Rictor的缺失会引起细胞骨架蛋白actin组装异常，使整个微丝网络的动态平衡受破坏，导致睾丸支持细胞极性丧失和血睾屏障结构破坏，最终导致无精症。 四、结论 1、Rictor/mTORC2是睾丸支持细胞正常发育和维持血睾屏障所必需的，血睾屏障损伤导致Rictor/mTORC2下调。 2、Rictor/mTORC2缺失导致精子发生障碍和雄性小鼠不育。 3、Rictor/mTORC2缺失后敲除鼠的睾丸支持骨架紊乱所致的细胞极性消失、血睾屏障完整性破坏是导致小鼠发生无精症的主要原因。 4、Rictor/mTORC2可能通过PKCα (S657)、Paxillin (Y118)与Rac1调节支持细胞的骨架结构与维持细胞极性。 5、睾丸支持细胞特异性Rictor敲除小鼠可为伴随血睾屏障损伤的无精症的研究提供新的模型。
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