摘要
自2015年起，由禽腺病毒（Ⅰ群，4型）引起的鸡心包积液-肝炎综合征在我国多个省份暴发，且发病率呈上升趋势。该病主要发生于3~5周龄雏鸡，以心包积液和包涵体肝炎为特征，病鸡表现为突然发病，迅速死亡，死亡率高达 30%~80%，给养禽业造成巨大的经济损失。目前对该病的防控主要采用禽腺病毒灭活疫苗等，而评价疫苗免疫效果的手段一般是监测其抗体水平。建立能够反映疫苗免疫后鸡群抗体水平变化趋势的检测手段对该病的防控具有重要意义。为此本论文采用全病毒作为抗原，建立了一种禽腺病毒（Ⅰ群，4型）抗体ELISA检测方法，并在临床中推广应用。 本研究中，采用G200分子筛、Macro-prep High Q阴离子交换层析联合超滤浓缩纯化禽腺病毒（I群，4型），病毒回收率为31.62%，在相同病毒含量的情况下病毒液中蛋白去除率为97.56%。然后采用纯化的禽腺病毒作为ELISA包被抗原，优化包被抗原浓度和包被条件，实验结果表明，抗原浓度2 μg/mL、4℃过夜包被的条件较好；优化ELISA板封闭条件，最终选择5% FBS、4℃过夜封闭的条件较好。然后对血清稀释浓度与反应条件、酶标二抗使用浓度与反应条件以及TMB底物反应条件进行了优化，发现血清稀释2000倍37℃反应1h、酶标二抗稀释10000倍37℃反应1 h、TMB底物室温避光反应10 min时，阳性血清OD450值大于1.5，阴性血清OD450值小于0.2， P/N值较大。 对实验室试制产品的特异性、敏感性进行了研究，结果表明本研究建立的ELISA方法与AIV、NDV、IBV、IBDV、REV、EDSV标准阳性血清（1∶2000）和30份SPF鸡阴性血清（1∶2000）不发生反应，OD450值均小于0.2，而与FAdV阳性对照血清（1∶2000）反应，OD450值均大于1.5；阳性质控血清稀释至1∶12800，其OD450值仍大于0.2。按照优化的ELISA条件和步骤检测疫苗免疫后鸡体FAdV抗体水平变化趋势，确定本研究FAdV抗体间接ELISA检测方法的判定标准为阳性对照血清OD450值大于1.0，阴性对照血清OD450值小于0.2时，试验成立；检测血清样品S/P值大于或等于0.2判定为阳性，S/P值为0.1~0.2判定为弱阳性，S/P值小于0.1时判定为阴性。同时对ELISA包被板的稳定性进行了研究，结果表明，ELISA包被板的批间差异小于10%，批内差异小于5%；保存12个月后其特异性、敏感性没有发生明显改变。使用本研究建立的ELISA方法检测来自广东、广西、云南鸡场的临床血清样本共计363份，结果表明FAdV抗体检测结果与疫苗免疫情况一致。 所有试验结果表明，本研究建立的ELISA方法对禽腺病毒血清抗体检测具有良好的敏感性、特异性、稳定性，该ELISA检测方法能够弥补目前市场上商品化试剂盒的不足，具有很好的市场应用前景。
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