摘要
目前对动物生殖发育的研究越来越重视，对生殖细胞的了解也渐渐深入，但对配子形成的基础研究，特别是灵长类配子研究仍然不足。原始生殖干细胞（Primordial germ cells，PGC）体外培养体系可以帮助准确理解生殖细胞分化机制和功能性生殖细胞发生。非人类灵长类原始生殖干细胞分化模型的建立，为人类建立了一个可行的研究平台，特别是在生殖细胞的基础研究和生育疾病治疗方面具有重要意义。体内原始生殖干细胞称为 PGC，而体外分化出的细胞称为原始生殖干细胞类细胞（Primordial germ cell like cells，PGCLCs）。本论文将Primed ESCs先分化为Na?ve ESCs，用它来诱导产生PGCLCs，并优化分化模式，分析各分化阶段细胞全性型基因和原始生殖干细胞相关基因表达，验证和证明猴PGCLCs的细胞特性，研究结果如下。 （1）利用化学转换的培养体系（含 CHIR99021、PDO325901、SB203580 和SP600125），将猴Primed ESCs培养转化为Na?ve ESCs。获得猴Na?ve ESCs细胞集落呈现圆弧形立体形态特征，通过免疫荧光染色验证其表达多能性标记物OCT4、SOX2和 NANOG，同时这些细胞还表达灵长类异性多能干细胞表面标记 TRA-1-81 蛋白，这些结果证实Primed ESCs被成功分化为Na?ve ESCs。 （2）添加多种细胞因子来调控ESCs分化方向（含BMP4、BMP2、LIF、SCF、和EGF），将猴Na?ve ESCs后分化PGCLCs。通过形成拟胚体途径将ESCs分化PGCLCs。确定在培养拟胚体时，所需最优细胞数为96孔U型低吸附细胞培养板每孔3000个，实现Na?ve ESCs平稳地向PGCLCs分化。通过免疫荧光染色验证PGCLCs表达多能性且保守的PGCs标记物Blimp1、TFAP2C、KIT和OCT4。它还表达人类特异性标志物SOX15和SOX17。 同时，通过qPCR分析这些特异性基因相对表达量，其也证实了猴PGCLCs多种基因表达趋势和体内PGCs表达趋势一致。这些结果证实了猴Na?ve ESCs被成功分化为PGCLCs。 综上所述，本论文建立和优化猴胚胎干细胞向原始生殖干细胞分化模式，建立和优化了Na?ve ESCs向PGCs分化模式，证明PGCLCs多种基因表达趋势和体内PGCs的特征基因表达谱一致，这些研究结果为研究原始生殖干细胞的形成及分化机理研究奠定了基础，也为其应用研究奠定了基础，对于生殖与发育科学提供了重要数据。
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