摘要
PRMT5是一类Ⅱ型蛋白质精氨酸甲基转移酶，参与调节不同基因pre-mRNA剪切，在植物应对生物和非生物胁迫中发挥重要作用。为进一步了解P RM T5 调节基因可变剪切相关功能，本论文以Col-0和prmt5-2为材料，利用RNA-seq技术分析P RM T5 突变导致基因发生错误可变剪切，并着重分析光呼吸相关基因可变剪切，探讨其产生错误可变剪切的可能功能，为光呼吸基因发生可变剪切及其调控光呼吸代谢中的作用研究提供实验基础。获得了主要结果如下： 1. PRMT5突变导致光呼吸相关基因产生错误可变剪切 通过RNA-seq，在拟南芥Col-0和prmt5-2中发现有7018个基因发生错误可变剪切，其中内含子滞留有 5211 个基因，并且prmt5-2 中内含子滞留明显多于Col-0，因此，PRMT5突变影响了基因的可变剪切，尤其是基因可变剪切的内含子滞留类型。这些发生错误可变剪切基因中，共发现20个光呼吸相关基因可能会发生可变剪切，经PC R和转基因互补实验证实PGLP1 等 11 个光呼吸基因在PRMT5突变后发生可变剪切，且发生可变剪切类型为内含子滞留。 2. 光呼吸相关基因产生错误可变剪切的可能功能 可变剪切不仅增加编码蛋白的多样性，也能产生提前终止密码子导致相关基因所编码蛋白被无义相关降解途径所降解。本论文利用无义相关降解途径相关T-DNA的突变体upf1和upf3与prmt5-2杂交，筛选获得upf1/prmt5-2和upf3/prmt5-2双突变体。利用这些双突变体证实GLT1和PGLP2产生的错误可变剪切在双突变体upf1/prmt5-2和upf3/prmt5-2中表达较prmt5-2上调，说明这两个基因产生错误可变剪切被无义相关途径降解；而另外9个发生可变剪切基因在双突变体和单突变体中表达差异不大，可变剪切产生mRN A s可能产生新的蛋白质，这仍需进一步实验证实。 3. AGT产生可变剪切对其酶活性的影响 由于AGT在prmt5-2 中产生错误可变剪切，可变剪切产生mRN A与无义相关的降解不相关，则可能产生新蛋白。对AGT因可变剪切产生转录本进行测序发现，在prmt5-2中AGT可转录产生3种不同的mRNAs，分别为编码AGT开放阅读框、AGT开放阅读框并滞留第一个内含子序列、AGT开放阅读框并滞留第一和第八个内含子序列；采用重组表达方式构建AGT3种不同mRNAs重组表达载体，通过浸花法浸染拟南芥Col-0和prmt5-2获得转基因纯合植株。结果表明：过量表达AGT开放阅读框和含两个内含子序列的转基因材料虽然提高AGT表达，但其对催化丙氨酸和谷氨酸的活性均有所降低。过量表达AGT开放阅读框转基因材料中AGT表达得到大量提高，其对催化谷氨酸的活性在Col-0和prmt5-2中均有较大提高，对催化丙氨酸的活性只在prmt5-2 中有提高；而过量表达AGT开放阅读框和含第一个内含子序列转基因材料虽然提高AGT表达，但对催化丙氨酸和谷氨酸的活性影响不大。这说明过量表达AGT开放阅读框能提高AGT酶活性，而过量表达AGT含有内含子转录本序列对酶活性影响不大，甚至抑制酶活性。 4. PRMT5调节基因的可变剪切的功能在水稻和拟南芥中相似 利用获得OsPRMT5基因编辑材料进行RNA-seq分析发现，OsPRMT5功能缺失也导致大量基因发生错误可变剪切，野生型水稻中花11中有2433个可变剪切事件为内含子滞留，而在OsPRMT5的基因编辑材料82-35中则有3267个内含子滞留事件，其他剪切类型差异不大；在水稻和拟南芥P RM T5功能缺失材料中均发现节律、开花延迟、剪切相关基因以及光呼吸相关基因发生可变剪切，说明P RM T5功能缺失导致基因在拟南芥和水稻中发生内含子滞留事件具有相似的功能。
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