摘要
目的： 巨噬细胞一直以来都被认为是非常重要的免疫细胞。巨噬细胞表达多种与抗原提呈相关的表面分子，通过吞噬作用，胞饮作用以及受体介导的胞吞作用摄取抗原。巨噬细胞也表达大量MHCⅠ类分子、MHCⅡ类分子和CD80、CD86、CD40等共刺激分子，在细胞内加工处理抗原。因此，巨噬细胞具有强大的抗原提呈能力及吞噬消化功能。巨噬细胞还可以分泌大量促炎性细胞因子，如IL-12、IL-23、IL-1、IL-6、IL-13和TNF等以及趋化因子CCL-2、CCL-3等，激活Thl型免疫应答，通过分泌高水平的细胞毒中间介质如NO、反应氧中间产物(reactive oxygen intermediates，ROI)等，介导杀伤肿瘤细胞和消化细胞内的微生物。因此认为巨噬细胞是机体免疫防御和抗肿瘤的重要效应细胞。巨噬细胞也可分泌高水平的免疫抑制性细胞因子，如IL-10、TGF-β及VEGF等，抑制炎症反应和免疫反应。近年来，许多研究表明，巨噬细胞是浸润到肿瘤组织中白细胞的主要成分。在肿瘤的早期巨噬细胞通过吞噬、杀伤肿瘤细胞以及提呈肿瘤相关抗原发挥免疫监视和抗肿瘤作用；在肿瘤的晚期巨噬细胞可以通过释放许多细胞因子和趋化因子促进肿瘤血管生成及其生长，并可以通过基质的降解促进肿瘤侵袭和转移。因此，了解巨噬细胞在肿瘤中的作用，调节巨噬细胞的功能，将巨噬细胞作为肿瘤免疫治疗的重要靶点，以发挥其免疫监视和抗肿瘤效应。 灵芝多糖(ganoderma lucidum polysaeeharides，Gl-PS)是灵芝的主要药效成分，具有免疫增强和抗肿瘤作用。目前关于其抗肿瘤作用机制的研究多集中于灵芝多糖对免疫功能的调节以及对端粒酶活性的影响和促分化等方面。经研究灵芝多糖在体外无直接抑瘤和诱导肿瘤细胞凋亡的作用，其抗肿瘤机制可能是调节宿主免疫功能，增强免疫细胞活性，进而抑制肿瘤的进展。研究证实，在体内外灵芝多糖均可活化T淋巴细胞，增强巨噬细胞吞噬功能，促进NO、IL-1β、TNF-α等的产生和释放，调节机体免疫功能。林志彬通过血清药理学实验以及体内外多种试验方法均证明灵芝多糖无直接的抗肿瘤作用，其抗肿瘤作用是通过促进TNF-α、IFN-γ mRNA等表达，增加TNF-α、IFN-γ的分泌，进而抑制肿瘤细胞或促进其凋亡。由此可见，灵芝多糖的抗肿瘤作用与其调节机体免疫功能密切相关。那么灵芝多糖对在细胞免疫应答中起重要作用的巨噬细胞及其分泌的细胞因子是否会产生影响，会产生怎样的影响，这种影响是否为灵芝多糖抗肿瘤作用的另一途径。本实验通过探讨灵芝多糖对LPS诱导的小鼠腹腔巨噬细胞TNF-α、CCL-2、IL-6、IL-10和IL-12分泌的影响，旨在发现灵芝多糖抗肿瘤作用的新机制。 方法： 1．细胞来源：本实验采用的腹腔巨噬细胞来源于C57BL/6j小鼠。 2．实验分组及干预：实验依据培养小鼠腹腔巨噬细胞的RPMI-1640完全培养基中所含灵芝多糖浓度不同进行分组，设0.2μg/ml、0.8μg/ml、3.2μg/ml、12.8μg/ml四个实验组，并以不加灵芝多糖组(0μg/ml)为空白对照，各组均含有相同浓度的LPS10μg/ml。 3．采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各组细胞培养上清中TNF-α、CCL-2、IL-6、IL-10和IL-12的含量。 4．采用实时荧光定量核酸扩增（qRT-PCR）技术，检测各组细胞TNF-α、CCL-2、IL-6、IL-10和IL-12在基因转录水平的表达差异。 5．数据统计分析：应用SPSS17.0统计学软件，对结果进行单因素方差分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。 结果： 1．从细胞因子分泌水平和基因水平检测灵芝多糖对LPS诱导的小鼠腹腔巨噬细胞分泌TNF-α的影响：在不同浓度灵芝多糖(0μg/ml、0.2μ/ml、0.8μg/ml、3.2μg/ml、12.8μg/ml)作用下，经LPS诱导的腹腔巨噬细胞连续培养24h，用ELISA法检测各组细胞培养上清中TNF-α的含量(pg/ml)，分别为310.705±18.196、378.631±15.448、379.777±20.712、391.189±24.264、403.730±29.753，可见随着灵芝多糖浓度的不断增高，小鼠腹腔巨噬细胞表达TNF-α的量越来越高，且呈现一定的剂量依赖关系，经方差分析，差异有显著性（F=11.692，P＜0.01）。qRT-PCR技术检测显示，小鼠腹腔巨噬细胞TNF-αmRNA的表达水平分别为1.000±0.000、1.081±0.003、1.083±0.003、1.085±0.005、1.087±0.002，以12.8μg/ml组TNF-αmRNA的表达水平最高，随着灵芝多糖浓度的不断增高，小鼠腹腔巨噬细胞TNF-αmRNA表达水平逐渐升高，呈现一定的剂量依赖关系，经方差分析，差异有显著性（F=506.873，P＜0.01）。 2．从细胞因子分泌水平和基因水平检测灵芝多糖对LPS诱导的小鼠腹腔巨噬细胞分泌CCL-2的影响：在不同浓度灵芝多糖(0μg/ml、0.2μ/ml、0.8μg/ml、3.2μg/ml、12.8μ/ml)作用下，经LPS诱导的腹腔巨噬细胞连续培养24h，用ELISA法检测各组细胞培养上清中CCL-2的含量(pg/ml)，分别为26.827±8.660、84.235±7.722、93.929±6.937、97.570±13.505、98.053±20.500，可见随着灵芝多糖浓度的不断增高，小鼠腹腔巨噬细胞表达CCL-2的量越来越高，且呈现一定的剂量依赖关系，经方差分析，差异有显著性(F=35.084，P＜0.01)。qRT-PCR技术检测显示，小鼠腹腔巨噬细胞CCL-2 mRNA的表达水平分别为1.000±0.000、1.055±0.004、1.057±0.006、1.059±0.004、1.060±0.002，以12.8μg/ml组的CCL-2 mRNA的表达水平最高，随着灵芝多糖浓度的不断增高，小鼠腹腔巨噬细胞CCL-2 mRNA表达水平逐渐升高，呈现一定的剂量依赖关系，经方差分析，差异有显著性（F=170.489，P＜0.01）。 3．从细胞因子分泌水平和基因水平检测灵芝多糖对LPS诱导的小鼠腹腔巨噬细胞分泌IL-6的影响：在不同浓度灵芝多糖(0μg/ml、0.2μg/ml、0.8μg/ml、3.2lμg/ml、12.8μg/ml)作用下，经LPS诱导的腹腔巨噬细胞连续培养24h，用ELISA法检测各组细胞培养上清中IL-6的含量(pg/ml)，分别为339.236±29.488、404.431±36.023、395.986±13.884、423.251±19.502、450.093±38.936，可见随着灵芝多糖浓度的不断增高，小鼠腹腔巨噬细胞表达IL-6的量越来越高，且呈现一定的剂量依赖关系，经方差分析，差异有显著性（F=15.375，P＜O.01）。qRT-PCR技术检测显示，小鼠腹腔巨噬细胞IL-6 mRNA的表达水平分别为1.000±0.000、1.031±0.003、1.033±0.004、1.039±0.004、1.048±0.012，以12.8μg/ml组的IL-6 mRNA的表达水平最高，随着灵芝多糖浓度的不断增高，小鼠腹腔巨噬细胞IL-6mRNA表达水平逐渐升高，呈现一定的剂量依赖关系，经方差分析，差异有显著性(F=27.382，P＜0.01)。 4．从细胞因子分泌水平和基因水平检测灵芝多糖对LPS诱导的小鼠腹腔巨噬细胞分泌IL-10的影响：在不同浓度灵芝多糖(0μg/ml、0.2μg/ml、0.8μg/ml、3.2μg/ml、12.8μg/ml)作用下，经LPS诱导的腹腔巨噬细胞连续培养24h，用ELISA法检测各组细胞培养上清中IL-10的含量(pg/ml)，分别为102.901±18.713、88.399±6.557、86.397±11.235、73.887±5.202、59.385±13.337，可见随着灵芝多糖浓度的不断增高，小鼠腹腔巨噬细胞表达IL-10的量越来越低，且呈现一定的剂量依赖关系，经方差分析，差异有显著性（F=11.123，P＜0.01）。qRT-PCR技术检测显示，小鼠腹腔巨噬细胞IL-10 mRNA的表达水平分别为1.000±0.000、0.987±0.006、0.982士0.002、0.981±0.002、0.974土0.004，以0μg/ml组的IL-10 mRNA的表达水平最高，随着灵芝多糖浓度的不断增高，小鼠腹腔巨噬细胞IL-10mRNA表达水平逐渐降低，呈现一定的剂量依赖关系，经方差分析，差异有显著性（F=27.094，P＜0.01）。 5．从细胞因子分泌水平和基因水平检测灵芝多糖对LPS诱导的小鼠腹腔巨噬细胞分泌IL-12的影响：在不同浓度灵芝多糖(0μg/ml、0.2μg/ml、0.8μg/ml、3.2μg/ml、12.8μg/ml)作用下，经LPS诱导的腹腔巨噬细胞连续培养24h，用ELISA法检测各组细胞培养上清中IL-12的含量(pg/ml)，分别为143.919±8.320、165.085±10.533、178.367±20.209、189.783±22.350、206.916±5.059，可见随着灵芝多糖浓度的不断增高，小鼠腹腔巨噬细胞表达IL-12的量越来越高，且呈现一定的剂量依赖关系，经方差分析，差异有显著性(F=15.464，P＜0.01)。qRT-PCR技术检测显示，小鼠腹腔巨噬细胞IL-12 mRNA的表达水平分别为1.000±0.000、1.014±0.005、1.019±0.002、1.023±0.006、1.026±0.002，以12.8μg/ml组的IL-12 mRNA的表达水平最高，随着灵芝多糖浓度的不断增高，小鼠腹腔巨噬细胞IL-12mRNA表达水平逐渐升高，呈现一定的剂量依赖关系，经方差分析，差异有显著性（F=26.436，P＜0.01）。 结论： 1．灵芝多糖可上调小鼠腹腔巨噬细胞分泌TNF-α、CCL-2、IL-6、 IL-12。 2．灵芝多糖可下调小鼠腹腔巨噬细胞分泌IL-10。
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