摘要
背景和目的： 肺癌是世界上危害人类最大的癌症，其发病率和死亡率均居所有癌症之首,其中非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer NSCLC)约占肺癌所有类型的85%。早期肺癌预后较好，但肺癌确诊时多数患者已是晚期，造成肺癌预后差。根据CSCO《2018年原发性肺癌诊疗指南》，对于不可切除的ⅢA期、ⅢB期NSCLC，基本治疗策略仍为含铂的双药化疗，对于Ⅳ期无驱动基因非鳞癌非小细胞肺癌的一线治疗的基本策略也为含铂双药方案，故顺铂在晚期肺癌的治疗仍存在重要的地位。近年来，NSCLC肺癌靶向治疗方面取得了极大的进展，但遗憾的是靶向药物及化疗药物均存在耐药问题，成为NSCLC治疗的重大阻碍，仍使NSCLC的预后不容乐观。因此研究NSCLC的化疗及靶向药物的耐药机制成为现今肿瘤治疗的热点问题。 近年来，表观遗传学与化学药物敏感性的研究逐渐成为热点。长链非编码RNA(Long non-codingRNA, LncRNA)是一种长度超过200个核苷酸的非编码RNA分子，其在基因沉默、转录激活、染色体修饰、核内运输等具有重要功能。与多种疾病的发展息息相关，其异常表达与肿瘤的形成、浸润、转移过程相关。 尿路上皮癌相关抗原1(Urothelial carcinoma associated1, UCA1)首次在膀胱癌细胞中被发现高度表达的LncRNA。后来在许多种肿瘤如乳腺癌、结肠癌、胃癌、肝细胞癌、舌鳞癌、食管癌、卵巢癌及黑色素瘤、非小细胞癌中都有发现。研究发现，UCA1可通过调节EMT和细胞调亡、参与肿瘤的发生和发展，同时与多种肿瘤的耐药有密切关系。但LncRNA UCA1对非小细胞肺癌中顺铂耐药的具体的分子机制不清楚。 本课题对Lnc RNA UCA1对顺铂耐药非小细胞肺癌细胞A549/DDP细胞的作用及其作用机制进行了研究及论证。包括以下三部分：第一部分：Lnc RNA UCA1在顺铂耐药非小细胞肺癌细胞A549/DDP细胞中的表达及对迁移侵袭的影响；第二部分：UCA1通过靶向miR-143发挥调控A549/DDP细胞的功能；第三部分：UCA1/miR-143/Wnt-β catenin对A549/DDP细胞迁移侵袭及IC50的影响。 第一部分：Lnc RNA UCA1在A549/DDP细胞中的表达及对其迁移侵袭的影响 方法： 1.通过MTT实验检测建立的顺铂耐药非小细胞肺癌细胞（A549/DDP）的抑制率和IC50。 2.通过Real time quantitative polymerase （ RT-qPCR ）的方法分别检测了UCA1 在非小细胞肺癌细胞（ A549 ）及顺铂耐药非小细胞肺癌细胞（A549/DDP）中的表达水平。 3.通过慢病毒介导法建立稳定敲减UCA1的顺铂耐药非小细胞肺癌细胞（A549/DDP）。 4.通过 Transwell 检测敲减 UCA1 对顺铂耐药非小细胞肺癌细胞（A549/DDP）迁移和侵袭的影响。 5.通过 Western blot 检测敲减 UCA1 对顺铂耐药非小细胞肺癌细胞（A549/DDP）中EMT相关蛋白E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Snail表达的影响。 结果： 1.建立的顺铂耐药非小细胞肺癌细胞（A549/DDP）的抑制率呈浓度依赖性，顺铂的IC50值为67.58±5.69μmol/L。 2.UCA1在A549/DDP细胞中的表达水平异常的升高。 3.成功建立了慢病毒稳定敲减UCA1的A549/DDP细胞。 4.敲减UCA1可抑制A549/DDP细胞的迁移和侵袭。 5.敲减UCA1可抑制A549/DDP细胞的EMT化。 第二部分：UCA1通过靶向miR-143发挥调控A549/ DDP细胞的功能 方法： 1.通过生物信息学分析推测UCA1的靶基因。 2.构建野生和突变型的UCA1的重组质粒，通过双荧光素酶报告实验验证mir-143为UCA1的靶基因。 3.通过Western blot和Real-time qPCR的方法检测UCA1过表达和敲减后miR-143的表达。 4.通过Transwell和Western blot的方法检测miR-143过表达对A549/DDP细胞迁移侵袭和EMT化的影响。 结果： 1.生物信息学预测显示miR-143为UCA1的靶位基因。 2.双荧光报告基因实验验证UCA1靶向miR-143。 3.UCA1可负向调控miR-143的表达。 4.过表达miR-143可抑制A549/DDP细胞的迁移侵袭及EMT化。 第三部分：UCA1/miR-143/Wnt-β catenin对A549/DDP细胞迁移侵袭及IC50的影响 方法： 1.通过western blot方法检测miR-143过表达对A549/DDP细胞 Wnt/β-catenin信号通路中WNT、β-catenin、CD44的表达水平的影响。 2.通过Transwell方法检测Wnt/β-catenin信号通路抑制剂对A549/DDP细胞迁移侵袭的影响。 3.通过MTT方法检测UCA1/miR-143/Wnt-β catenin信号通路对A549/DDP细胞IC50的影响。 结果： 1.过表达 miR-143 可下调 A549/ DDP 细胞 Wnt/β-catenin 信号通路中WNT、β-catenin、CD44的蛋白表达水平。 2.抑制Wnt/β-catenin信号通路可抑制A549/DDP细胞的迁移和侵袭。 3.敲减UCA1、过表达miR-143及抑制Wnt-β catenin信号通路均可不同程度逆转顺铂对A549/DDP细胞的耐药性。 结论： 1.顺铂耐药非小细胞肺癌细胞（A549/DDP）中UCA1的表达水平显著升高，miR-143的表达水平显著降低，Wnt/β-catenin信号通路异常激活，且均可促进A549/DDP细胞的迁移侵袭及EMT化。 2.miR-143可失活Wnt/β-catenin信号通路，进而抑制其促进A549/DDP细胞的迁移侵袭及EMT化。 3.UCA1可靶向负调控miR-143的表达水平，从而促进A549/DDP细胞的迁移侵袭及EMT ，且过表达miR-143可抑制A549/DDP细胞的迁移侵袭及EMT化。 4.敲减UCA1可通过调控miR-143/Wnt-β catenin通路逆转A549/DDP细胞的耐药性。
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