摘要
【目的】 本研究利用基因工程技术分别在小鼠 Oct4/Sox2/Klf4/c-Myc 基因 5’末端引入小分子泛素样修饰蛋白(SUMO)和细胞穿膜肽(TAT)。通过体外融合表达及酶切纯化，以期获得大量具备穿膜活性的 TAT-Oct4/Sox2/Klf4/c-Myc 蛋白，为实现利用重编程因子蛋白诱导体细胞成为 iPS细胞，并为最终获得用于产生血小板的前体细胞奠定基础。 【方法】 利用PCR技术，从pET20b-SUMO-FGF21质粒中扩增得带Nde I、BamH I和Kpn I酶切位点的SUMO-TAT融合基因，经双酶切连接，插入到pET-3c载体中。再从TetO-FUW-OSKM质粒中扩增得带Kpn I和Bgl II酶切位点的小鼠Oct4基因以及分别带Kpn I和BamH I酶切位点的Sox2/Klf4/c-Myc基因，将上述四基因分别进行双酶切后与经Kpn I和BamH I双酶切的pET3c-SUMO-TAT克隆载体连接，构建得重组原核表达载体pET3c-SUMO-TAT-Oct4/Sox2/Klf4/c-Myc，然后进行菌落PCR和酶切鉴定。将鉴定正确的重组子转化到Rosseta(DE3)宿主菌中 ， 筛选阳性菌落进行扩大培养 ， 经 IPTG 诱导表达SUMO-TAT-Oct4/Sox2/Klf4/c-Myc融合蛋白，使用SDS-PAGE检测分析目的蛋白的存在形式，然后利用Ni-NTA亲和层析进行分离纯化。经过SUMO蛋白酶酶切和再次 Ni-NTA 亲和层析获得 TAT-Oct4/Sox2/Klf4/c-Myc 蛋白，Western blotting分析其特异性。 【结果】 构建得 pET3c-SUMO-TAT-Oct4/Sox2/Klf4/c-Myc 原核表达载体，转化Rosseta(DE3)后经终浓度为 1 mmol/L 的 IPTG 诱导 4 h 后表达相应的SUMO-TAT-Oct4/Sox2/Klf4/c-Myc 融合蛋白，可溶性分析显示均以包涵体形式存在。经Ni-NTA亲和层析可获得分子量大小分别约为64 kDa、57 kDa、78 kDa、75 kDa 的 SUMO-TAT-Oct4/Sox2/Klf4/c-Myc 纯化蛋白。将获得的纯化蛋白经SUMO 蛋白酶酶切后再通过 Ni-NTA 亲和层析获得纯度较高的TAT-Oct4/Sox2/Klf4/c-Myc融合蛋白。Western blotting检测显示良好特异性。 【结论】 本研究成功构建了pET-SUMO-TAT-Oct4/Sox2/Klf4/c-Myc原核表达载体，通 过 Rossate （ DE3 ）宿主菌的表达得到了大量的SUMO-TAT-Oct4/Sox2/Klf4/c-Myc融合蛋白 ， 酶切纯化后得到了TAT-Oct4/Sox2/Klf4/c-Myc融合蛋白，为后期使用细胞穿膜肽介导干细胞因子进入体细胞内进行重编程的研究奠定基础。
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