摘要
【目的】 探究蛋白激酶A (protein kinase A，PKA)在血小板凋亡中所发挥的作用。 【方法】 采集健康志愿者空腹静脉全血，分离得到洗涤血小板及富含血小板血浆（Platelet rich plasma， PRP），调整血小板的浓度至3×108/ml。人的洗涤血小板与不同浓度的PKA抑制剂H89或对照二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）于22℃孵育160min，利用Western blot检测血小板PKA底物GPIbβ（Ser166）的磷酸化程度，用电子显微镜观察血小板的形态改变。人的洗涤血小板与H89(37.5 μM)或对照DMSO于22℃孵育不同的时间，使用流式细胞仪检测血小板线粒体跨膜电位（ Mitochondrial inner transmembrane potential，ΔΨm）变化和磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine ，PS）外翻程度。洗涤血小板与不同浓度的PKA激活剂Forskolin或阴性对照（DMSO）在室温下孵育10min，然后用ABT737（1μM）在37℃条件下处理90min，利用流式细胞仪检测血小板 ΔΨm和PS外翻的变化。采集6-8周三种PKA（PKA+/+、PKA+/-、PKA-/-）基因型小鼠下腔静脉全血，分别检测血小板的数量，PKA蛋白的表达情况和PKA底物GPIbβ的磷酸化程度，并且检测血小板ΔΨm去极化程度。给野生型ICR小鼠注射PKA 的抑制剂 Rp-cAMPS，之后使用血细胞计数仪检测小鼠体内血小板数量。从糖尿病患者和正常人全血中分别分离血小板和富含血小板血浆（Platelet rich plasma， PRP），使用Western blot检测血小板中PKA底物GPIbβ的磷酸化程度，用ELISA法检测血小板中PKA的活性，并利用流式细胞仪检测血小板ΔΨm和PS外翻的变化。利用 ELISA 法检测糖尿病患者和正常人血浆中凝血酶产生的情况。在体外分别用Forskolin 和不同浓度的凝血酶处理血小板，利用流式细胞仪检测血小板 ΔΨm 和 PS外翻的变化。 【结果】 H89能够导致血小板中PKA底物GPIbβ去磷酸化，ΔΨm去极化，PS外翻，质膜皱缩。Forskolin能够抑制由ABT737诱导的血小板ΔΨm去极化，PS外翻。与PKA+/+小鼠相比，PKA-/-小鼠体内血小板数量明显减少，PKA 蛋白表达量明显减少，PKA底物GPIbβ的磷酸化程度降低，血小板ΔΨm去极化。此外，PKA的抑制剂Rp-cAMPS能够导致野生型 ICR 小鼠体内血小板数量减少。与正常对照组相比，糖尿病患者组血小板的PKA底物GPIbβ的磷酸化程度降低，ΔΨm去极化和PS外翻。糖尿病患者组血浆中凝血酶的含量明显高于正常对照组。体外实验中，凝血酶能够诱导血小板凋亡，并且Forskolin能够抑制由凝血酶诱导的血小板凋亡。 【结论】 这些数据表明：PKA能够调控线粒体介导的血小板凋亡，PKA与某些疾病中血小板数量的减少相关。这些发现为血小板减少症患者的诊断和治疗提供了新的思路。
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