摘要
背景： 多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是起源于骨髓浆细胞的一种恶性血液肿瘤。MM多发生于中老年人，随着我国社会老龄化的进展，多发性骨髓瘤这一中老年人好发的疾病越来越常见，发病人数将逐年增长。流行病学调查发现，不同的MM患者对治疗的反应、生存时间等均有较大的差异，因此，对于MM患者在诊断之初应该进行危险度分层从而指导规范化的治疗。细胞遗传学标志是多发性骨髓瘤危险度分层的主要依据之一，MM的遗传学检查结果对于患者的诊断分层、预后判断和治疗选择均非常重要。 由于多发性骨髓瘤细胞在骨髓中呈现不均匀分布的特点，单次骨穿很可能无法取得足够数量的浆细胞，加上MM细胞增殖周期较长，普通短期培养法及G显带染色体分析很难获得足够的细胞分裂像，通常获得阳性检查结果的可能性较少。目前临床常用的是分裂间期荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization，FISH），有相当一部分患者由于标本中 MM 细胞数量过少而出现假阴性结果。为了提高 MM 的检出率，采用CD138免疫磁珠阳性分选技术（Magnetic activated cell sorting，MACS）是目前常用的分选技术，可以富集浆细胞，提高遗传学异常的检出率。但免疫磁珠分选需要专门的仪器设备，且所用的试剂价格较高、分选需要的时间较长，限制了在临床特别是基层医院的推广使用。因此，在现阶段亟待研发一种简单快捷的实验新技术以提高MM的临床检出，特别是细胞遗传学的检出率。 骨髓瘤细胞来源于较早期的B细胞，故可表达高度异质性的B细胞系抗原。CD45是白细胞共同抗原，在所有的白细胞表面均有表达，但在正常浆细胞、幼稚红细胞表面不表达，绝大多数MM患者肿瘤细胞CD45-，仅少数为CD45+。故可以针对骨髓瘤细胞的这一免疫表型特点，采用 CD45阴性分选的方式，从骨髓中分选富集骨髓瘤细胞。又因为部分骨髓瘤细胞为CD45+表型，且骨髓中的原始、早幼红细胞也是CD45-，所以还需要寻找一种方法来将骨髓瘤细胞进一步和CD45-的原始、早幼红细胞分开。 微流控芯片是一种通过纳米级的加工手段，把多种生物化学功能微缩、集成到一块大小仅为几平方厘米的载体上的系统。基于微流控芯片的细胞分选思路主要有两大类，一类是根据细胞的表面化学性质实现目的细胞的分选富集，还有一类是根据不同细胞的物理性质（如体积、密度、介电常数）不同来实现细胞分选。多发性骨髓瘤细胞较正常血细胞体积大，平均直径在 28.8μm 左右，故可以通过肿瘤细胞和正常细胞的体积差异进行进一步细胞分选。确定性侧向位移的原理即是流体中的颗粒通过微柱阵列时，体积大于和小于临界值的颗粒移动模式不同，从而能够把不同大小的颗粒分开。 本课题拟结合阴性细胞分选技术和微流控芯片分选技术，开发一种操作简单、价格相对低廉、对细胞损伤较小的MM细胞分选方法，用于临床分选、富集浆细胞，提高细胞遗传学异常的检出率，为多发性骨髓瘤的精准治疗决策提供依据。 目的： 探索利用RosetteSepTM Human CD45试剂阴性分选多发性骨髓瘤患者骨髓浆细胞的方法；制作基于确定性侧向位移（Deterministic lateral displacement, DLD）原理的微流控细胞分选芯片，测试其对不同大小细胞分选的能力；结合上述两种技术，建立多发性骨髓瘤患者骨髓标本中的瘤细胞分选方法，提高遗传学检出率。 方法： 1. 搜集初诊/复发多发性骨髓瘤患者的骨髓标本，流式细胞检测多发性骨髓瘤细胞的比例。将患者的标本经过RosetteSepTM Human CD45试剂处理，并进行密度梯度离心，流式细胞检测多发性骨髓瘤细胞的比例，比较分选前后肿瘤细胞的比例，验证该试剂用于骨髓瘤细胞富集方法的效果。 2. 制作用于分选肿瘤细胞的 DLD 微流控细胞分选芯片。利用人多发性骨髓瘤细胞株KM3和健康人外周血混合物模拟分选，验证DLD微流控芯片的分选能力。 3. 搜集临床初诊或复发MM患者骨髓标本，CD45阴性分选结合微流控芯片分选骨髓中的多发性骨髓瘤细胞。流式细胞术分别检测分选前、后样本中的骨髓瘤细胞比例。荧光原位杂交技术分别检测分选前、后样本的细胞遗传学异常。根据分选前后细胞遗传学异常的检查结果，参照IMWG的危险度分层标准，对分选前后患者的危险度分层进行比较。 结果： 1.用RosetteSepTM Human CD45试剂阴性分选的方法，共分选了我院初诊多发性骨髓瘤患者骨髓标本9例，均符合《中国多发性骨髓瘤诊治指南》中多发性骨髓瘤诊断标准，其中男性7例，女性2例，年龄45至78岁（中位年龄63岁）。分选前的肿瘤细胞比例为（10.15±8.29）%，分选后的肿瘤细胞比例为（39.00±20.17）%，分选后的肿瘤细胞比例高于分选前，其差异有统计学意义（t=-5.159，p=0.001）。 2. 成功制作基于确定性侧向位移的细胞分选微流控芯片。整个芯片设计包括一个样品入口，两个出口和一个带微柱阵列的中央流道。流道长35mm，宽3.5mm，高30μm，微柱横截面三角形边长为30μm，微柱之间的间距为30μm，芯片中的微柱阵列相对于流体流动方向具有3.2°的倾斜角。使用KM3细胞和健康人外周血混合样本模拟分选，细胞悬液从样品入口流入芯片流道，外周血细胞和体积较大的 KM3 细胞随机进入中央流道或两侧微柱阵列，大细胞流经微柱阵列时与微柱发生碰撞后产生确定性侧向位移，逐渐向流道的中心集中，最终从中央的样品出口流出被搜集；小细胞沿着微柱流线方向流动，逐渐向两侧聚集，从废液出口流出；部分一开始从中央流道进入芯片的红细胞和白细胞，沿着原流向，从中央的产品出口直接流出。当进样流速为0.1mL/min、0.5mL/min、1mL/min、2mL/min时，KM3细胞的回收率分别为95.0%、92.3%、92.0%、89.3%。 3.CD45阴性分选结合微流控芯片技术（microfluidicchip CombinedCD45 depletion with tetrameric antibody complexes,MF-CD45-TAC）分选方法分选68例临床初诊或复发多发性骨髓瘤患者骨髓样本，分选前骨髓瘤细胞比例中位数为7.85（0.05，60.20）%，分选后骨髓瘤细胞比例中位数为43.50（0.5，97.8）%。统计分析提示分选后的样本骨髓瘤细胞比例高于分选前，其差异有统计学意义（T=6.890，P=0.000）。分选前 FISH总阳性率为32.4%，分选后FISH检查总阳性率为63.5%；分选后的样本在IgH基因断裂重排、13q14 缺失、1q21 扩增的检出率均高于分选前样本（P＜0.05）；分选后样本17p缺失检出比分选前多4例，差异无统计学意义（P＞0.05）。参照IMWG的危险度分层标准，分别按分选前和分选后的细胞遗传学结果对68例患者进行危险度分层评价,发现分选对MM患者的诊断分层结果有影响，分选后中、高危组的比例较分选前增加（P＜0.05）。 结论： MF-CD45-TAC 分选法能够从多发性骨髓瘤患者骨髓标本中富集肿瘤细胞。相较于免疫磁珠分选方法而言， MF-CD45-TAC 分选法的优势有：对样本量要求较小（1~2mL）；分选目的细胞不需要有特异性的标记；不需要专门的分选设备；分选操作简单、耗费时间较短；分选成本较低。但是 MF-CD45-TAC分选法在分选出的细胞纯度方面不如免疫磁珠分选。综合成本、操作难易程度、样本消耗、遗传学异常检出率等多方面的因素考虑，MF-CD45-TAC 分选法是一种有临床推广使用潜力的细胞分选方法。 MF-CD45-TAC 还有进一步研究和改进的空间： （1）优化分选流程保留 CD45 阳性的多发性骨髓瘤细胞。 （2）将研究将多个分选步骤集成到一块多功能微流控芯片上，或者集成到一个多芯片系统上，进一步提高分选过程的自动化程度，减少人工干预步骤，降低操作的难度，为将来这一技术在基层医院的临床推广应用提供便利。 （3）设计更加严密、病例数更多的的临床随机对照研究，进一步比较磁珠分选和MF-CD45-TAC分选方法的优劣性。
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