摘要
1.1. 研究背景和目的 胰腺导管癌是目前全世界范围内致死率最高的消化道恶性肿瘤之一，发病率长期跻身癌谱前十位并有不断上升的趋势，且患者的预后极差，5年生存率不足5%。目前对胰腺导管癌的治疗手段主要是手术切除。然而，由于胰腺导管癌发病隐匿、进展迅速等特点，大多数患者在确诊时已经处于晚期或伴随着远端转移而错失手术治疗机会。据统计，仅有不到 15%的患者能够进行手术切除，且术后一年内复发率高达 50%以上。常规的化疗和放疗对胰腺导管癌的治疗效果有限，因此，如何提高胰腺导管癌的早期诊断及改进治疗方案一直是胰腺导管癌治疗问题的关键所在。 肿瘤免疫疗法是近年来兴起的一种新型治疗方法，主要通过激发机体免疫系统来增强肿瘤微环境的抗肿瘤能力, 控制和杀伤肿瘤细胞的一种新型治疗方法。正常生理情况下，免疫系统能有效的识别"自我"与"非我"，对进入体内的抗原和体内发生癌变的细胞起到"免疫监视"的作用，然而癌变细胞通常会通过多种机制逃避机体的免疫监视，"无限"增殖形成肿瘤，不仅如此，肿瘤微环境还能通过多种途径促使免疫细胞耗竭以抑制机体免疫功能，使肿瘤得以发展。因此，决定肿瘤免疫疗法疗效的关键在于能否重新启动并维持肿瘤免疫功能。T淋巴细胞、自然杀伤细胞（NK）、树突状细胞（DC）等都具有一定的肿瘤杀伤活性，但机体肿瘤免疫疗法主要是以T淋巴细胞为核心执行者。目前研究最热的免疫疗法包括CAR-T（嵌合抗原受体）免疫疗法、CTLA-4（细胞毒T淋巴细胞相关抗原4）免疫疗法、PD-1/PD-L1（程序性死亡受体1及其配体）免疫疗法等等，在许多临床治疗中疗效显著, 逐渐成为继手术、放疗和化疗后的第4类肿瘤治疗方法。其中，目前已上市的PD-1抗体明显延长了黑色素瘤、前列腺癌和非小细胞肺癌等肿瘤患者的生存时间，使得PD-1疗法越来越受到人们的关注。近来，有文献报道胰腺导管癌患者外周血和肿瘤组织中CD8+T淋巴细胞表面PD-1 表达与胰腺导管癌病人的预后密切相关，提示 PD-1 有望成为胰腺导管癌免疫检查点阻滞剂治疗的靶点。但从现有的 PD-1抗体治疗胰腺导管癌的临床数据来看，其治疗效果并不理想。PD-1抗体治疗仅对极少数胰腺导管癌患者有效，那些同样是PD-1表达阳性的患者可能有着截然不同的疗效。因此，亟需找到可以用来判断是否适合PD-1抗体治疗的生物学标志，以筛选适合PD-1抗体治疗的胰腺导管癌患者。 最近，Mary Philip和SchietingerA等人所在的两个研究组报道了小鼠肿瘤浸润淋巴组织（TILs）高表达 PD-1，且其分化会经历两个独立的染色质状态，并且这些状态能够反应到相应的表面标记上：一种是可塑的功能失调状态（state 1），这个状态的PD-1+CD8+T细胞低表达CD38和CD101，这群细胞通过体外刺激具有重新分泌IFN-γ 和 TNF-α 从而恢复其肿瘤杀伤功能的能力；另一种则是稳定的功能失调状态（state 2），这个状态的PD-1+CD8+T细胞高表达CD38和CD101，并且没有恢复分泌 IFN-γ和 TNF-α的能力。我们推测胰腺导管癌患者体内可能也存在这两群细胞，它们可能对 PD-1 抗体治疗具有完全不同的效果。而且，这两群不同功能状态的PD-1+CD8+T 细胞在胰腺导管癌患者体内的频率可能是胰腺导管癌患者预后的关键指标。 因此，本课题通过对胰腺导管癌患者的外周血、癌组织中的PD-1+CD8+T细胞表面CD38/CD101的表达和分布情况进行研究，分析CD38+CD101+PD-1+CD8+T细胞与胰腺导管癌患者的性别、年龄、肿瘤部位、组织学分级、肿瘤大小、肿瘤累及范围、淋巴结转移、远端转移和临床分期的相关性以及在胰腺导管癌患者预后中所起的作用，探讨其临床意义。 1.2. 研究方法 应用流式细胞仪检测胰腺导管癌患者和正常人外周血单核细胞中PD-1+/PD-1-的CD8+T 细胞总频率以及CD38+CD101-/CD38-CD101+/CD38-CD101-/CD38+CD101+的PD-1+/PD-1-CD8+T淋巴细胞亚群的频率，比较其差异性；运用统计学方法分析各CD8+T淋巴细胞亚群的频率与胰腺导管癌临床病理参数的相关性；运用免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）染色和免疫荧光染色技术（Immunofluorescence，IF）检测CD38和CD101分子在胰腺导管癌病人肿瘤组织浸润淋巴细胞中的表达和共定位，运用多种统计学方法分析其与胰腺导管癌的临床相关性和预后相关性。 1.3. 研究结果 1.3.1. 第一部分 胰腺导管癌患者与健康人外周血CD3+CD8+T细胞表面PD-1、CD38、CD101的表达水平比较。 我们运用密度梯度离心法从胰腺导管癌患者和健康对照者外周血中提取单核细胞，按比例分别加入CD3、CD8、PD-1、CD38、CD101流式抗体染色。接着用流式细胞术（FCM）检测分析PD-1+/CD38+CD101-PD-1+/CD38-CD101+PD-1+/CD38-CD101-PD-1+/CD38+CD101+PD-1+的CD8+T淋巴细胞各亚群的频率；同时，我们还分析了PD-1-CD8+T细胞亚群中PD-1阴性表达、CD38/CD101单阳性、双阳性和双阴性表达的细胞频率。运用独立样本t检验比较患者与健康对照间的表达差异，结果显示：胰腺导管癌患者外周血中除了CD38+CD101-PD-1+CD8+T和CD38+CD101-PD-1-CD8+T细胞亚群外，其余细胞亚群频率与健康人相比均存在差异，且差异具有统计学意义（P<0.05）。 1.3.2. 第二部分 胰腺导管癌患者外周血CD8+T细胞中PD-1、CD38、CD101的表达与其临床相关性分析及比较 1）根据第一部分的流式结果和病例统计结果，按各细胞亚群频率的中位数将患者外周血CD8+T淋巴细胞中PD-1、CD38、CD101的表达水平分为高表达和低表达，用卡方检验分析各分子表达水平与胰腺导管癌临床参数的相关性。结果显示，所有的 CD8+T 细胞亚群均与患者年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤部位及分化程度无关（P>0.05）；在所有亚群中，只有CD38/CD101在PD-1+CD8+T中的双阳性表达与肿瘤累及范围（T）、淋巴结转移（N）、远端转移（M）及临床分期均显著相关（P<0.05）；而PD-1在CD8+T细胞中的阳性表达及阴性表达虽与淋巴结转移（N）、远端转移（M）和临床分期显著相关，但与肿瘤累及范围（T）无关；CD38、CD101在PD-1+CD8+T细胞亚群中的双阴性表达仅与肿瘤累及范围（T）和远端转移（M）显著相关，而两者的单阳性表达与胰腺导管癌临床参数均无相关性；在 PD-1-CD8+T 细胞亚群中， CD38、CD101在PD-1-CD8+T细胞中的双阳性表达仅与肿瘤累及范围（T）和远端转移（M）显著相关，而两者的单阳性表达及双阴性表达与所有胰腺导管癌临床参数均不相关。 2）我们分别以真阳性率（灵敏度）为纵坐标，假阳性率（ 100%-特异度）为横坐标绘制ROC曲线，曲线下面积（AUC）被用于比较PD-1+CD8+T细胞中各个亚群频率关联胰腺导管癌患者肿瘤累及范围（T）、淋巴结转移（N）、远端转移（M）及临床分期（C）的能力。我们发现，只有CD38/CD101在PD-1+CD8+T中的双阳性表达最有能力关联胰腺导管癌肿瘤累及范围（T）、是否发生淋巴结转移（N）、是否远端转移（M）以及临床分期（C）。结果提示，可以通过测量胰腺导管癌患者外周血CD38+CD101+PD-1+CD8+T 细胞频率来预测胰腺导管癌发生转移的高危性并对判断其临床分期和肿瘤分期起到辅助性作用。 1.3.3. 第三部分 CD38/CD101在胰腺导管癌组织浸润淋巴细胞（TILs）中的共表达与临床相关性分析和预后分析 1）我们运用免疫组织化学实验检测了胰腺导管癌患者肿瘤组织TILs中CD38和CD101的表达部位和水平，发现CD38和CD101在胰腺导管癌癌组织中都过表达，且主要表达在TILs包膜上。癌旁组织和正常组织中淋巴细胞浸润非常少，因此均不表达该两种蛋白。我们运用免疫荧光双染技术检测CD38/CD101在胰腺导管癌组织芯片中的共定位和共表达水平。结果显示，CD38和CD101的表达情况与免疫组化结果一致且存在共定位，临床分期越高，共表达细胞数量越多。按照共表达细胞数量的中位数，将患者分为高表达组和低表达组进行临床相关性分析，发现CD38/CD101的高表达与胰腺导管癌T分期、N分期、M分期及临床分期均相关（P<0.05），而与患者的年龄、性别、肿瘤大小和位置及分化程度均无关（P>0.05）。 2）接着我们进行了Kaplan-Meier生存分析，发现与CD38/CD101低表达患者相比，CD38/CD101 高表达的胰腺导管癌患者生存时间短；Cox 多因素回归分析，发现CD38/CD101的高表达是胰腺导管癌患者预后的独立危险因素。 1.4. 结论 1）CD38/CD101 在胰腺导管癌患者外周血 PD-1+CD8+T 细胞中高表达，在正常人中低表达，表达差异具有统计学意义。 2 ） PD-1+CD8+T 细胞中 CD38/CD101 双阳性表达频率相较于 PD-1+/CD38+CD101-PD-1+/CD38-CD101+PD-1+/CD38-CD101-PD-1+CD8+T细胞及PD-1-CD8+T细胞各亚群而言，与胰腺导管癌T/N/M分期和临床分期具有更强的相关性；PD-1+CD8+T和 PD-1-CD8+T 细胞亚群总频率虽与胰腺导管癌 N/M 分期和临床分期具有相关性，但与T分期没有相关性。 3）CD38/CD101在胰腺导管癌癌组织TILs中高表达，在癌旁和正常胰腺组织中低表达。CD38/CD101 的高表达与胰腺导管癌患者的 T/N/M 分期和临床分期显著相关，并且双表达细胞数量越多，患者生存期越短，预后越差。Cox 多因素回归分析发现 CD38/CD101 的高表达是胰腺导管癌患者的独立危险因素，有望作为胰腺导管癌预后诊断的生物学标记。 综上，胰腺导管癌患者外周血 CD38+CD101+PD-1+CD8+T 细胞频率及肿瘤组织TILs中 CD38/CD101的高表达与胰腺导管癌的临床参数和预后相关性最为密切，而PD-1+CD8+T 细胞总频率虽与胰腺导管癌 N/M 分期和临床分期具有相关性，但与 T分期没有相关性。因此，与PD-1在CD8+T细胞上的单表达相比，CD38CD101PD-1在CD8+T细胞上的共表达可能是一个新的、更好的胰腺导管癌预后指标，并可能对胰腺导管癌患者抗PD-1/PD-L1免疫治疗起到一定的指导作用。
NETL