摘要
肺癌是最常见的、死亡率最高的疾病之一，小细胞肺癌（Small Cell Lung Cancer，SCLC）约占肺癌的20%，恶性度高，倍增时间短，转移早且广泛，常规检查X线、CT及MRI对SCLC的诊断缺乏特异性，常在确诊时已到了SCLC的晚期。SCLC对化疗、放疗敏感，治疗一般以全身化疗为主，但毒副作用很大，且容易复发、产生耐药性，预后不佳，治疗后两年生存率小于5%。因此，针对SCLC难诊断、难治疗的现状，迫切需要寻找易于早期诊断和有效治疗的方法。 分子影像学是未来发展最具发展潜力的十个医学科学前沿领域之一，超声分子影像学的基础就是构建能较长时间定向地聚积于靶组织或器官上的高特异性超声微泡，使超声图像在靶区特异性增强或进行局部靶向治疗。目前临床用的超声微泡不能透过血管内皮，属于血池成像。纳米级超声微泡粒径更小、穿透力更强，可穿过血管内皮在血管外特定的靶区聚集，实现肿瘤的血管外显影，纳米微泡可作为药物载体，将多肽、抗体等物质稳定携载于微泡中，同时还可以包裹治疗药物用于临床靶向治疗。SCLC细胞上存在胃泌素释放肽受体，本研究将抗前胃泌素释放肽单克隆抗体携载于纳米微泡造影剂上，成功制备了抗前胃泌素单克隆抗体靶向纳米微泡造影剂，检测靶向纳米微泡造影剂在SCLC中的增强显影效果。制备了载紫杉醇靶向纳米微泡，分析了其对SCLC细胞增殖、细胞凋亡、细胞迁移的影响及对SCLC裸鼠移植瘤的作用，获得的主要结果如下： 1. 纳米微泡的制备及对SCLC裸鼠移植瘤的增强显像效果。应用薄膜水化法制备纳米微泡造影剂，纳米微泡呈球形，分布均匀，无聚集，粒径是392.1 nm，电位是-16.8 mv；纳米超声微泡在体外超声造影时对SCLC H446细胞无明显毒性作用；纳米微泡在裸鼠成瘤模型的移植瘤中达峰时间、峰值减半时间明显高于微米微泡(p<0.05) ，而到达时间、峰值强度及曲线下面积二者则无显著性差异(p>0.05)；纳米微泡在移植瘤中与肝脏中作对比发现，移植瘤中的达峰时间、峰值强度及曲线下面积明显低于肝脏，峰值减半时间明显高于肝脏(p<0.05)，而到达时间二者无显著差异(p>0.05)，结果表明纳米微泡提高了肿瘤的超声成像能力。 2. 靶向SCLC的抗前胃泌素释放肽单克隆抗体纳米微泡的制备及超声检查。由于SCLC可分泌大量的胃泌素释放肽且细胞上存在胃泌素释放肽受体，制备抗前胃泌素释放肽单克隆抗体，利用巯基乙胺将抗前胃泌素释放肽单克隆抗体打开，链接于纳米微泡上，制备了靶向检测SCLC的纳米微泡。制备的靶向纳米微泡造影剂，透射电镜下呈球形，无聚集，粒径是378.1 nm，电位是-15.2 mv，靶向纳米微泡与空白纳米微泡粒径相比无统计学差异(p>0.05)；采用高效液相色谱法证实靶向纳米微泡中链接有单克隆抗体IgG1；激光共聚焦显微镜发现靶向纳米微泡与H446细胞特异性结合，黏附率96.2%；靶向纳米微泡在SCLC荷瘤裸鼠模型移植瘤中的峰值强度、曲线下面积及峰值减半时间明显高于空白纳米微泡（p<0.05），而到达时间及达峰时间两者无显著性差异(p>0.05)；病理组织学证实靶向纳米微泡穿过了SCLC血管内皮进入肿瘤组织间隙，表明抗前胃泌素释放肽单克隆抗体靶向纳米微泡提高了SCLC的超声成像。 3. 载紫杉醇抗前胃泌素释放肽单克隆抗体靶向纳米微泡增强了紫杉醇诱导SCLC细胞凋亡的能力。制备的载紫杉醇靶向纳米微泡，包封率高、载药率良好，粒径是452.1 nm，电位是-15.8 mv，稳定性好；采用CCK8法检测其对H446细胞增殖的影响，发现在给药24 h时载紫杉醇靶向纳米药物组对H446细胞的抑制作用显著高于对照组(p<0.05)，且靶向纳米药物对H446细胞的抑制作用随浓度增加而增强，在10 μM载紫杉醇靶向纳米微泡与其它药物相比差异最显著(p<0.01)；细胞流式技术检测其对H446细胞凋亡的调控作用，发现使用浓度10 μM的载紫杉醇靶向纳米药物组对H446细胞凋亡率显著高于对照组(p<0.01)；划痕实验发现载紫杉醇靶向纳米微泡显著抑制了H446细胞迁移，表明载紫杉醇靶向纳米微泡增强了紫杉醇诱导SCLC细胞凋亡的能力，同时增强了紫杉醇抑制SCLC细胞增殖和迁移的能力， 4. 载紫杉醇抗前胃泌素释放肽单克隆抗体靶向纳米微泡抑制了SCLC肿瘤的生长。建立SCLC裸鼠移植瘤模型，使用空白纳米微泡、紫杉醇、载紫杉醇纳米微泡、载紫杉醇靶向纳米微泡分别对其进行作用，发现载紫杉醇靶向纳米微泡组裸鼠体重、瘤体体积及瘤体重量较对照组均显著降低（p<0.05），显著抑制了肿瘤生长。RT-PCR、Western-blot和免疫组化结果表明载紫杉醇靶向纳米微泡处理组的细胞增殖相关蛋白Bcl-2、Survivin、CDK2的表达水平显著下降；迁移相关蛋白MMP-2的蛋白水平显著下调，而mRNA水平没有显著变化；凋亡相关蛋白Caspase-3的蛋白水平和mRNA水平显著上调，抑癌基因Rb的蛋白水平显著上调。表明载紫杉醇抗前胃泌素释放肽单克隆抗体靶向纳米微泡有望作为一种潜在的治疗SCLC的新型靶向药物。 本研究首先制备了纳米微泡，在此基础上合成了抗前胃泌素单克隆抗体靶向纳米微泡，首次实现了利用抗前胃泌素单克隆抗体靶向纳米微泡造影剂对SCLC进行超声检测，并成功制备了载紫杉醇靶向纳米微泡，载紫杉醇靶向纳米微泡增强了紫杉醇诱导SCLC细胞凋亡的能力，同时增强了紫杉醇抑制SCLC细胞增殖和迁移的能力，并能有效抑制SCLC裸鼠移植瘤的生长，本研究为进一步提高SCLC的超声诊断和靶向治疗提供了重要的理论基础，并具有潜在的应用价值。
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