摘要
叶片是植物完成光合作用的重要器官，在漫长的进化历程中，植物的叶片演变出不同的形态，而不同形态的叶片则会对植物光能利用效率及生长速率产生影响，进而影响植物本身的品质与产量。本课题组前期在田间发现一甜瓜掌状裂叶突变体，通过研究发现甜瓜叶片形状受一对等位基因控制，其中隐性单基因pll控制裂叶性状。因此，本文对该甜瓜突变体的pll基因进行克隆并测序，然后进行信息学分析。利用RT-PCR半定量方法检测分析了全缘叶材料伽师瓜、老汉瓜与裂叶材料BM7中PLL基因表达量之间的差异。利用Crispr/Cas9技术，构建PLL基因敲除载体，并利用农杆菌进行遗传转化，建立甜瓜PLL基因Crispr/Cas9遗传转化体系，为PLL基因功能的研究奠定坚实的基础，为甜瓜中其他未知功能的基因研究提供新思路、新方法1。主要结果如下： （1）提取裂叶材料BM7叶片的DNA，对pll基因进行克隆，PCR扩增得到3021bp的基因全长，之后进行了信息学分析。结果如下：经分析pll基因预测编码的蛋白质分子式为C9676H16275N3079O4112S584，分子质量为260261.87kDA，等电点pI为4.87。通过对其磷酸化位点进行分析，结果显示该蛋白可能含有Ser磷酸化位点42个，Thr磷酸化位点5个，Tyr磷酸化位点9个。对其编码的蛋白三级结构进行预测，pll蛋白与ATERF1蛋白相似度最高，相似性为40.54%。 （2）对全缘叶材料和裂叶材料中的PLL基因表达差异进行研究，琼脂糖凝胶电泳结果显示，PLL基因在全缘叶材料伽师瓜和老汉瓜中表达，在裂叶材料BM7中不表达。 （3）成功构建甜瓜全缘叶基因PLL的Crispr/Cas9敲除载体，通过冻融法将甜瓜全缘叶基因PLL的Crispr/Cas9敲除载体转入农杆菌。 （4）对甜瓜叶片及愈伤组织耐受潮霉素以及头孢的临界浓度进行检测，发现甜瓜耐受潮霉素的最大浓度为10mg/L，耐受头孢的最大浓度为600mg/L。对转化后的农杆菌以及在生芽培养基中长出的菌落进行头孢抗性检测，发现原始菌没有头孢抗性，但在生芽培养基中长出的农杆菌菌落产生了头孢抗性，且其耐受头孢浓度为300mg/L。 （5）对甜瓜进行遗传转化，得到18株转化植株。扩增潮霉素抗性基因进行阳性检测，有14株阳性植株。对靶位点序列进行扩增并测序，结果显示靶位点以及靶位点附近的序列并无基因突变。 综上所述，虽无突变成功的阳性植株，但已初步对甜瓜裂叶基因的功能进行研究，并建立了甜瓜全缘叶基因PLL的Crispr/Cas9遗传转化体系，为甜瓜裂叶基因的功能的全面探究打下坚实的基础。
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