摘要
近年来有关中草药的研究越来越多，由于中草药多糖可以增强机体的细胞免疫及体液免疫，成为了多种疫苗佐剂的热点材料。新疆野生荒漠肉苁蓉为列当科、肉苁蓉属，寄生植物，盛产于中国西北部地区，被人们誉为“沙漠人参”，多糖作为肉苁蓉主要成分之一，具有免疫调节及抗肿瘤作用，其原因在于多糖不仅可以刺激增强免疫系统，对机体的正常细胞几乎没有副作用。流感疫苗在预防流行性流感和季节性流感中发挥了极大的作用，流感疫苗中通过使用佐剂，增强了免疫反应强度。目前铝佐剂是临床上主要使用的佐剂，缺陷是铝佐剂对于流感疫苗不能激发出足够的细胞毒性T细胞作用，因此研究新型的佐剂对于大流感的预防具有重要的现实意义。 本文通过新疆荒漠肉苁蓉多糖（ Aqueous extract of Cistanche deserticola, AECD）配伍流感疫苗(influenza virus split vaccine，IVV)不同免疫方式免疫小鼠，检测其对小鼠细胞免疫和体液免疫反应的影响，通过建立小鼠肿瘤模型，研究新疆野生荒漠肉苁蓉多糖的抗肿瘤效果，为新疆荒漠肉苁蓉多糖作为流感疫苗的候选佐剂及抗肿瘤相关研究提供实验参考。 1. AECD对IVV佐剂活性的研究 水提醇沉法提取AECD，通过将AECD和流感疫苗配伍皮下和肌肉不同免疫途径免疫小鼠，评价AECD的佐剂效果。实验分三个部分，第一部分：不同浓度AECD与流感疫苗配伍皮下注射小鼠，通过ELISA法检测血清中抗体及其亚型水平，MTT法检测脾脏淋巴细胞增殖，流式细胞术检测脾脏T细胞的百分比例表达，筛选最佳AECD剂量。实验结果显示：AECD 400μg为最佳配伍流感疫苗的剂量，AECD显著增加了IgG的水平，能同时激起Th1和Th2的免疫反应，同时显著增加CD4+和CD8+T细胞的比例。第二部分：在第一部分实验基础上将AECD 400μg与不同剂量流感疫苗配伍，研究其作为佐剂的抗原节约效果。 实验结果显示：AECD 400μg多糖与低剂量流感疫苗配伍后对比单独流感疫苗组对IgG、IgG1和IgG2a、淋巴细胞的增殖、脾脏T细胞表面分子CD44的表达、DC表面分子（CD40、CD80、CD86、MHCII）及细胞因子的表达均有显著促进效果，同时下调了CD4+CD25+Foxp3+Treg（Regulatory cells）细胞的比例，与单独流感疫苗高剂量免疫组相比以上指标均没有显著性差异性，表明可以节约抗原用量。这些结果证明AECD作为佐剂不但能激起更强的体液及细胞免疫水平，也起到了节约疫苗剂量作用。第三部分实验：AECD配伍流感疫苗肌肉免疫小鼠，评价AECD作为流感疫苗佐剂的肌肉免疫效果。实验结果表明：AECD作为流感疫苗的佐剂能够激起更强的IgG、IgG1和IgG2a的表达，也能显著刺激的脾淋巴细胞增殖，显著激起CD4+、CD8+T细胞、DC细胞表面分子（CD40、CD80、CD86、MHCII）及细胞因子的百分比例，证明AECD作为佐剂配伍流感疫苗后通过肌肉免疫也能激起更强的体液及细胞免疫强度。 2. AECD免疫作用机制及抗肿瘤效果的初步研究 近年来对多糖免疫作用机制研究逐步展开， 对AECD作为佐剂的免疫作用机制研究很少，本实验在前期实验表明AECD具有很好佐剂作用的基础上，希望利用DC体外培养平台初步探讨AECD与DC作用的膜受体及其对DC成熟的影响。主要通过检测AECD是否通过DC表面的 TLR 4促进DC的成熟。结果显示：不同浓度的AECD均可以显著刺激起DC表面分子CD40和CD80的表达，证明AECD可以刺激DC成熟。 随后通过加入TLR 4抑制剂后，AECD低剂量实验组和AECD高剂量实验组对比未加入抑制剂组的CD86和CD40表达量均显著降低，初步说明AECD可能通过TLR 4信号通路刺激DC成熟。 肿瘤相关实验结果表明：体外AECD刺激肿瘤时间24 h、48 h和72 h均在多糖浓度达到625μg/mL时出现抑制肿瘤生长的迹象，且随着AECD浓度的升高，肿瘤的抑制情况更加明显。证明AECD在体外具有较强的抑瘤效果。 3. AECD的纯化与结构表征的解析 上述实验说明AECD具有疫苗免疫增强作用，但由于荒漠肉苁蓉多糖为大分子，结构十分复杂，现如今对其研究极少，本实验即通过DEAE-52纤维素层析柱对粗多糖进一步纯化，对纯化后多糖进行结构的初步解析。经过层析柱的纯化共得到两种AECD纯化物，分别是AECD-I和AECD-II，分子量分别为2.65×104 Da和3.23×104 Da，紫外全波段扫描结果显示两种组分均含有少量蛋白质，但不含核酸等杂质。 基于以上结果，判断AECD分子量较大结构较为复杂，本实验仅对AECD进行纯化并进行简单的结构解析，实验结果为后续研究荒漠肉苁蓉提供了参考依据。
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