摘要
基于高含量的类胡萝卜素所带来的营养价值和感官品质，如何提高和丰富柑橘类胡萝卜素的色泽品质成为人们日益关注的热点。AtPIF1是前人报道的一个能够直接调控类胡萝卜素合成基因表达的转录因子。因此，研究柑橘中PIF基因与柑橘类胡萝卜素的形成之间的关系有着非常重要的意义。 本研究以红肉、清家、华盛顿、纽荷尔脐橙，国庆一号温州蜜柑，白马叙、红马叙葡萄柚果实及叶片为实验材料，利用反转录PCR方法克隆到了两个CsPIF基因cDNA全长序列：CsPIFL和CsPIFS，并对其核苷酸序列及其编码的蛋白质的氨基酸序列进行了生物信息学分析。同时，利用Realtime-PCR等方法分析了两个CsPIF基因在基因组中的拷贝数及其器官组织表达特异性。进而探索了红光对PIF基因及对编码类胡萝卜素合成限速酶之一的PSY基因表达量的影响。除此之外，还构建了两个CsPIF基因的超量表达载体。主要研究结果如下： 1．利用公共的柑橘基因组数据库，通过Reverse Transcript-PCR技术，从清家脐橙、红肉脐橙、华盛顿脐橙、纽荷尔脐橙、国庆一号温州蜜柑，白马叙葡萄柚、红马叙葡萄柚果实中克隆了CsPIF基因，序列分析后发现主要存在两个CsPIF基因：CsPIFL和CsPIFS。两者同源性高达95%，存在19个氨基酸差异，CsPIFL比CsPIFS多4个氨基酸。这两个蛋白氨基酸序列中均具有典型的bHLH结构域、APB模体及核定位信号且与PIF家族中UNEIO(PIF8)高度同源。通过Real-time PCR方法对各品种中两个不同CsPIF基因的拷贝数进行初步的探索。 2．对七个柑橘品种的叶片、汁胞及白马叙葡萄柚及红马叙葡萄柚果皮中总CsPIF相对表达量进行了分析，表明：叶片中的PIF相对表达量最高，果皮中其次，汁胞中最低。 3．将国庆一号温州蜜柑的愈伤组织和转色期的果实分别置于红光或白光下处理ld和2d，发现：在果皮中，红光处理较白光对照总CsPIF、CsPIFL和CsPIFS表达量均下调，而PSY基因表达量则为上调，刚好与PIF相反。在愈伤组织中，红光处理ld后，总CsPIF、CsPIFS、CsPIFL和PSY的表达量均下调；而红光处理2d后，总CsPIF、CsPIFS、CsPIFL及PSY的表达量均上调，所有的CsPIF与PSY表达量趋势一致。不论在果皮还是愈伤组织中，CsPIFL平均表达量始终低于总CsPIF表达量的一半，而是CsPIFS平均表达量的5倍以上。 4．通过HPLC(High Performance Liquid Chromatography)分析了不同光质处理后国庆一号温州蜜柑愈伤组织和转色期果实类胡萝卜素含量。结果表明：两种组织中主要存在5中类胡萝卜素，即紫黄质、叶黄素、α-胡萝卜素、β-胡萝卜素和八氢番茄红素；愈伤组织中以八氢番茄红素为主；果皮中则以p-胡萝卜素为主，八氢番茄红素的含量最低。果皮中，红光处理组与白光对照组相比：八氢番茄红素和总类胡萝卜素均增加，且红光处理1d后总类胡萝卜素的含量呈极显著增加。而在愈伤组织中，红光处理ld后八氢番茄红素和总类胡萝卜素均增加，但处理2d后，均降低。 5．成功构建了CsPIF基因的超量表达载体，为以后的功能验证奠定了基础。
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